【摘要】：持綠性指植物生長后期葉片衰老或黃化延緩而保持綠色的特性,與植物抗衰老、抗生物及非生物脅迫、增加產(chǎn)量等密切相關(guān),被認(rèn)為是作物的理想農(nóng)藝性狀。對功能性持綠基因的研究與利用是解決雜交水稻早衰、突破水稻現(xiàn)有生產(chǎn)力的一條可行的技術(shù)路徑。本研究以早衰秈稻金23B和持綠秈稻R287為材料,利用生物信息學(xué)、基因工程以及分子生物學(xué)的方法,對水稻持綠性候選基因OsPPDK基因進(jìn)行克隆。通過熒光定量PCR分析在水稻生長后期OsPPDK基因的表達(dá)差異,并測定了不同N濃度處理下不同部位OsPPDK基因的表達(dá)量。同時成功構(gòu)建了 ds1301-OsPPDK RNAi載體和pU1300-OsPPDK超表達(dá)載體,將構(gòu)建完成的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入金23B和R287中,并測定轉(zhuǎn)基因植株OsPPDK基因的表達(dá)量。獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1、根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫的TaNAM基因設(shè)計(jì)引物,成功從金23B葉片cDNA中PCR擴(kuò)增獲得水稻OsPPDK序列。通過測序結(jié)果可知目標(biāo)片段長為2844bp,對該序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)水稻OsPPDK基因編碼947個氨基酸,翻譯的蛋白是穩(wěn)定的酸性親水性蛋白,位于細(xì)胞質(zhì)中,為胞質(zhì)型PPDK(cyPPDK),其蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲及延伸鏈四種結(jié)構(gòu)組成,且該蛋白不具備跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽。2、通過熒光定量PCR分析金23B和R287抽穗期、灌漿期、乳熟期和蠟熟期OsPPDK在不同組織部位(葉片和葉鞘)的表達(dá)量情況,發(fā)現(xiàn)OsPPDK在金23B和R287的四個時期均有表達(dá)。在葉片和葉鞘中,抽穗期和灌漿期表達(dá)量較低;而在乳熟期和蠟熟期表達(dá)量相對較高,表達(dá)情況則存在較大差異,在乳熟期,R287葉片中OsPPDK的表達(dá)量是金23B的2.32倍,而在葉鞘中則為1.48倍;而在蠟熟期,金23B葉片的OsPPDK的表達(dá)量是R287的7.34倍,而在葉鞘中,其表達(dá)量則無明顯差異。3、根據(jù)對OsPPDK基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示,發(fā)現(xiàn)OsPPDK基因具有3個N元素結(jié)合域,因此對金23B和R287幼苗進(jìn)行不同氮濃度處理。測定OsPPDK在不同組織部位的表達(dá)量情況。熒光定量PCR結(jié)果表明,OsPPDK基因在不同氮濃度生長的葉片中均有表達(dá),其中金23B中OsPPDK表達(dá)量普遍高于R287。兩個品種間在葉片和根中,OsPPDK表達(dá)量隨著氮濃度的升高而增加,但表達(dá)差異卻相反,在葉中1/2氮濃度下,金23B的表達(dá)量為R287的2.86倍,而在2倍濃度下,基本表達(dá)量相當(dāng);而在根中,則相反,在1/2氮濃度下,表達(dá)量最低且相當(dāng),在2倍濃度下表達(dá)差異最大,金23B的表達(dá)量是R287的4.63倍。說明OsPPDK基因的表達(dá)受N濃度影響.。4、成功構(gòu)建了 OsPPDK基因的pU1300-OsPPDK超表達(dá)載體和ds1301-OsPPDK RNAi載體,并對金23B和R287愈傷通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,成功獲得轉(zhuǎn)化株。其中金23B OsPPDK超表達(dá)植株有7株,其中陽性植株有6株;金23B OsPPDK-RNAi植株3株,其中陽性植株有1株;R287 OsPPDK-RNAi植株2株,均為陽性植株,沒有得到R287 OsPPDK超表達(dá)植株。對轉(zhuǎn)化株進(jìn)行表達(dá)量分析,結(jié)果顯示:在6株超表達(dá)陽性轉(zhuǎn)化株中,OsPPDK表達(dá)量普遍增加,其中最低增加2.4倍,最高增加6.43倍;而在3株RNAi陽性轉(zhuǎn)化株中,金23B RNAi陽性轉(zhuǎn)化株表達(dá)量下調(diào)了 48%,而2株R287 RNAi陽性轉(zhuǎn)化株表達(dá)量分別下調(diào)了 43%和57%,說明構(gòu)建的載體成功轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)化株中并能對OsPPDK表達(dá)產(chǎn)生影響。
【學(xué)位授予單位】：湖北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S511
【圖文】：

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【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2731277