【摘要】：全球氣候變暖、夏季頻繁出現(xiàn)的高溫天氣(尤其是夜間高溫)造成水稻減產(chǎn)和稻米品質(zhì)下降,威脅我國糧食安全,因而探究水稻耐熱的分子機(jī)理、選育耐熱水稻優(yōu)良品種刻不容緩。本研究應(yīng)用RNA-Seq和全長轉(zhuǎn)錄本PacBio測序,從基因轉(zhuǎn)錄水平上分析了水稻應(yīng)答灌漿期夜間高溫的基因表達(dá)模式;利用iTRAQ蛋白標(biāo)記技術(shù)和液相質(zhì)譜鑒定技術(shù),從蛋白質(zhì)組水平上鑒定了水稻應(yīng)答灌漿期夜間高溫的差異表達(dá)蛋白;進(jìn)而通過基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)模式聯(lián)合分析,確定了與信號傳導(dǎo)相關(guān)基因Os05g0585500(LOC_Os05g50810)是參與調(diào)控水稻灌漿期耐夜間高溫的關(guān)鍵候選基因。進(jìn)一步對這一關(guān)鍵候選基因進(jìn)行序列比對、靶位點(diǎn)設(shè)計(jì),構(gòu)建了攜帶LOC_Os05g50810基因靶位點(diǎn)的特異性CRISPR/Cas9表達(dá)載體。取得的主要研究結(jié)果如下:(1)RNA-seq分析和PacBio的全長轉(zhuǎn)錄本測序獲得26,327個全長轉(zhuǎn)錄本的序列及它們的表達(dá)模式,利用iTRAQ蛋白標(biāo)記技術(shù)和液相質(zhì)譜鑒定技術(shù)鑒定了3,130個蛋白質(zhì)及其表達(dá)豐度。表達(dá)模式分析顯示,耐熱純系和熱敏感純系之間存在差異表達(dá)倍數(shù)大于1.5倍的轉(zhuǎn)錄本有10,996個,耐熱純系和熱敏感純系間存在差異表達(dá)倍數(shù)大于1.5倍的蛋白質(zhì)有70個。(2)源于蛋白質(zhì)組分析結(jié)果的上述70個差異表達(dá)基因的功能主要涉及光合作用、生物合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、防御反應(yīng)、逆境應(yīng)答、能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原、信號傳導(dǎo)。進(jìn)一步通過基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)模式的聯(lián)合分析,發(fā)現(xiàn)了一個鈣依賴的信號傳導(dǎo)蛋白基因LOC_Os05g50810,該基因在耐熱純系和熱敏感純系間的(mRNA)差異表達(dá)倍數(shù)僅0.97倍,而其編碼蛋白的差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)1.93倍,表明轉(zhuǎn)錄組中微小的變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)組顯著變化。在鈣依賴的信號傳導(dǎo)蛋白中,該基因編碼蛋白在耐熱純系和熱敏感純系間的差異表達(dá)水平最高,結(jié)合前人研究結(jié)果,故而確定參與Ca~(2+)依賴的信號傳導(dǎo)的基因LOC_Os05g50810為調(diào)控水稻灌漿期耐夜間高溫的關(guān)鍵候選基因。(3)根據(jù)測序獲得的全長轉(zhuǎn)錄本序列及其數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果,設(shè)計(jì)基因靶位點(diǎn),構(gòu)建了攜帶LOC_Os05g50810基因靶位點(diǎn)的特異性CRISPR/Cas9表達(dá)載體,為繼續(xù)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化、打靶效率檢測、候選基因的生物學(xué)功能驗(yàn)證奠定了研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S511
【圖文】：

high）的肽段，其中，可用于蛋白定量的特異肽段為 12,911段經(jīng) Uniport 數(shù)據(jù)庫搜索，最終鑒定了 3,130 個蛋白質(zhì)。D 和蛋白 ID 的匹配及其定量分析長轉(zhuǎn)錄本序列比對到數(shù)據(jù)庫后獲得 26,327 個轉(zhuǎn)錄本；蛋白質(zhì)肽段和特異肽段經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索后鑒定了 3,130 個蛋白質(zhì)。根據(jù)質(zhì)組共匹配上了 2,085 個基因的 ID，仍有 24,242 個轉(zhuǎn)錄本的能蛋白質(zhì) ID，有 1,045 個蛋白質(zhì)沒有匹配上相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本 ID（

有 1,045 個蛋白質(zhì)沒有匹配上相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本圖 2.1 檢測到的全長轉(zhuǎn)錄本數(shù)量和功能蛋白數(shù)量及其交集umber of full-length transcripts and functional proteins detected and達(dá)量經(jīng) FPKM 值轉(zhuǎn)換后，進(jìn)一步分析高溫處理和常溫表明：耐熱純系的高溫處理與常溫對照之間差異表達(dá)倍本；熱敏感純系的高溫處理與常溫對照之間差異表達(dá)錄本。蛋白質(zhì) iTRAQ 標(biāo)記與分析檢測到的 3,130 個蛋與常溫對照之間差異表達(dá)倍數(shù)超過 1.5 倍的有 63 個蛋與常溫對照之間差異表達(dá)倍數(shù)超過 1.5 倍的僅有 38 個蛋

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2730922