【摘要】：過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)是一種由配體激活的核轉錄因子,在脂類代謝調控中發(fā)揮重要作用。本研究旨在克隆鴿(Columba livia)PPARγ基因的全長cDNA序列,并分析該基因編碼的蛋白質理化性質和結構特征,揭示其組織表達特征。以鴿脾臟組織總RNA為模板,采用快速擴增cDNA末端(rapid amplification cDNA ends,RACE)方法,克隆到PPARγ基因的cDNA序列,并運用生物信息學的方法對其進行分析,運用實時熒光定量PCR檢測PPARγ基因在鴿心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和肌肉組織中的表達情況。研究結果表明,鴿PPARγ基因(Gen Bank No.KU166859.2)cDNA全長1 846 bp,包含1 428 bp的開放閱讀框,63 bp的5'端非編碼區(qū)和355 bp的3'端非編碼區(qū),共編碼475個氨基酸。經預測,鴿PPARγ基因編碼的蛋白質由7 661個原子組成,分子式為C2436H3840N644O714S27,等電點為6.19,相對分子質量為54.438 79 k D,平均親水性為-0.287。結構預測表明,鴿PPARγ蛋白具有2個鋅指結構以及配體結合域。鴿PPARγ氨基酸序列與杜鵑(Cuculus canorus)、鴨(Anas platyrhynchos)、鸚鵡(Melopsittacus undulates)、斑胸草雀(Taeniopygia guttata)、火雞(Meleagris gallopavo)、雞(Gallus gallus)、鵪鶉(Coturnix japonica)、豬(Sus scrofa)、人(Homo sapien)、小鼠(Mus musculus)和斑馬魚(Danio rerio)的同源性分別為97%、97%、96%、96%、96%、96%、96%、92%、91%、90%和64%。構建的系統(tǒng)發(fā)生樹顯示,鳥類和哺乳動物各形成一個大的分支,斑馬魚形成一個獨立分支,與鴿的聚類順序較近的物種為杜鵑和鴨,該結果與這些物種在生物學上的分類是基本一致的。熒光定量PCR結果顯示,PPARγ基因在肺組織中的表達量最高,較高表達于腎臟、肝臟、脾臟和心臟,而在肌肉組織中的表達量最低。本研究獲得了鴿PPARγ基因的cDNA序列、分子的結構特點及組織表達特征,提示可能與其在不同組織中的功能有關,該結果為進一步研究PPARγ結構和功能提供了理論依據(jù)。
【圖文】：

農業(yè)生物技術學報JournalofAgriculturalBiotechnology所得的序列設計并合成5'RACE和3'RACE特異性引物，以脾臟總RNA為模板，采用GeneRacerTMKit試劑盒分別合成5'RACE和3'RACE模板，然后參照試劑盒說明書進行5'RACE和3'RACEPCR反應，電泳檢測分別得到大小約400bp(圖1B)和480bp(圖1C)的特異性條帶，PCR擴增產物經回收克隆測序獲得的長度分別為335和484bp。通過對上述獲得的片段進行拼接，獲得鴿PPARγ基因的全長cDNA序列，共計1846bp，包括5'端非編碼區(qū)(5'UTR)為63bp，3'端非編碼區(qū)(3'UTR)為355bp，編碼區(qū)(CDS)序列長度為1428bp，編碼475個氨基酸。序列已提交GenBank登錄號：KU166859.2(圖2)。2.2鴿PPARγ蛋白特征的生物信息學分析通過ExPASy蛋白質組服務器中的ProtParam工具分析鴿PPARγ預測蛋白的生理生化特性，其等電點為6.19，分子量為54438.79，由7661個原子組成，分子式為C2436H3840N644O714S27，負電荷氨基酸殘基總數(shù)為65(Asp+Glu)，正電荷氨基酸殘基總數(shù)為59(Arg+Lys)，蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為52.33，脂肪系數(shù)為89.12。通過ProtScale工具分析其親疏水性，結果發(fā)現(xiàn)，最小值為-2.744，位于第157個氨基酸殘基，具有高親水性，最大值為3.600，位于第386和387個氨基酸殘基，具有較強的疏水性。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在27~30、58~62、91~101、151~163、183~188、239~241、259~261、267~274、422~426和458~460等區(qū)域具有較高的親水性(Score＜-1)，而在324~328和383~391等區(qū)域具有明顯的疏水性(Score＞1)(圖3)，平均親水性為-0.287。應用SMART在線程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)對鴿PPARγ蛋白質結構域進行預測，結果顯示，鴿PPARγ具有2個C4-鋅指結構模塊參與的核激素受體DNA?

hietal.,2008)。此外，PPARγ在免疫調節(jié)方面發(fā)揮重要作用(Bensinger,Tontonoz,2008)。由于組織表達分布與其功能是密切相關的，PPARγ基因的表達主要分布在脂肪代謝和免疫調節(jié)活躍的組織中，因而與本研究結果一致。其他禽類動物中有關PPARγ基因的組織表達情況也進行了報道，但結果存在一定的差異，可能是由于物種、日齡和營養(yǎng)水平等差異引起的。研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ基因在30周齡雞脂肪組織中表達量為所有檢測組織中最低，這與哺乳動物的研究結果截然相反，另外，PPARγmRNA在肝臟、骨骼肌和卵巢組織中的表達水平隨圖3鴿PPARγ蛋白親水性/疏水性分析Figure3Thehydrophilicity/hydrophobicityanalysisofpigeonPPARγprotein-3-2-10123450100150200250300350400450位置Position分評coreS圖4鴿PPARγ蛋白質保守結構域分析Figure4TheconservedproteindomainanalysisofpigeonPPARγZnF_C4：C4鋅指；HOLI：激素受體的配體結合域；鴿PPARγ蛋白具有明顯的ZnF_C4結構域和HOLI結構域ZnF_C4:C4zincfinger;HOLI:Ligandbindingdomainofhormonereceptors;TheproteinofpigeonPPARγwaspredict-edtodistinctlyhaveZnF_C4andHOLIdomain0100200300400634

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本文編號：2730771