【摘要】：卡巴拉汀(Rivastigmine,(S)-3-[1-(dimethylamino)ethyl]phenyl ethyl(methyl)carbamate)是一種可有效治療阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease)的藥物。N-乙基甲基氨基甲酸-3-[(1S)-羥乙基]-苯基酯((S)-NEMCA-HEPE)是制備卡巴拉汀的關(guān)鍵中間體。本論文利用醛酮還原酶(aldo-keto reductases,AKRs)催化還原N-乙基-甲基氨甲�；揭彝�(NEMCA)制備(S)-NEMCA-HEPE,并通過構(gòu)建重組全細胞以及引入添加劑策略來提高AKRs催化該反應(yīng)的速率及轉(zhuǎn)化率。針對不對稱還原NEMCA生成(S)-NEMCA-HEPE這一反應(yīng),在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索潛在的可催化該反應(yīng)的酶源。最終選定枯草桿菌168(Bacillus subtilis 168)基因組,并從中獲得三種AKRs基因(ytbE,iol S,yhd N),在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達,最佳誘導(dǎo)溫度為25℃,IPTG終濃度0.1 mM。蛋白經(jīng)過鎳柱純化后得到純的ytbE、iolS和yhdN酶,其比活力分別為0.6 U/mg、2.4 U/mg和0.5 U/mg。對AKRs進行酶學(xué)性質(zhì)研究,發(fā)現(xiàn)AKRs酶適合在30-40℃以及pH 6.5-7.0這一中性或中性偏酸的磷酸緩沖液中發(fā)揮較好的活性。此外,除了金屬離子Ca~(2+)和Mg~(2+)對iolS和yhdN的酶活有微弱激活作用外,大部分金屬離子均對AKRs活性產(chǎn)生不同程度的抑制作用,以重金屬離子Cu~(2+)和Fe~(3+)對AKRs酶活抑制最為明顯。將三種AKRs酶用于催化制備(S)-NEMCA-HEPE的反應(yīng)中。從反應(yīng)結(jié)果來看,不同的AKRs在不同輔因子存在時都可以催化NEMCA發(fā)生還原反應(yīng),得到對映體過量值(e.e._p)為99.9%的(S)-NEMCA-HEPE。當(dāng)NAD~+參與輔因子循環(huán)時,iolS、ytbE和yhdN催化該反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率分別為10.1%、15.3%和0.8%;而當(dāng)NADP~+存在反應(yīng)系統(tǒng)時,iolS、ytbE和yhdN催化該反應(yīng)得到的轉(zhuǎn)化率分別為19.2%、18.4%和5.7%,可見三種AKRs在不同輔因子存在時表現(xiàn)出不同的催化活性,并且都優(yōu)先選擇依賴輔因子NADP~+。在所有AKRs催化的反應(yīng)中,iolS酶在NADP~+存在時催化反應(yīng)的活性最佳,在24h內(nèi)得到最高的轉(zhuǎn)化率19.2%。為了研究不同AKRs催化該反應(yīng)存在的差異,利用分子對接(molecule docking)分析三種AKRs和底物NEMCA結(jié)合時產(chǎn)生的相互作用,發(fā)現(xiàn)AKRs中的氨基酸與NEMCA之間形成的氫鍵相互作用以及π-π相互作用對羰基還原反應(yīng)有著促進的作用,其中氫鍵相互作用對該反應(yīng)的發(fā)生尤為重要。為了避免向反應(yīng)中額外加入輔因子,降低反應(yīng)成本,本論文構(gòu)建了含有AKR和葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase,GDH)的三種重組全細胞用于催化該還原反應(yīng)。iolS-GDH、ytbE-GDH和yhdN-GDH重組全細胞可在1 h內(nèi)催化還原NEMCA,且反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率分別為83.3%、80.0%和78.2%,iolS-GDH全細胞具有最佳催化活性。三種AKRs-GDH全細胞催化該反應(yīng)的趨勢符合游離AKRs酶催化的結(jié)果,但全細胞催化可顯著提升該反應(yīng)的速率和轉(zhuǎn)化率,并且(S)-NEMCA-HEPE的e.e._p仍保持在99.9%。為進一步提高全細胞催化反應(yīng)的速率和轉(zhuǎn)化率,向反應(yīng)體系中引入不同類型的添加劑,如離子液體(ILs)、深共熔溶劑(DESs)和有機試劑。其中,5%(v/v)離子液體([BMIm]BF_4)的加入對反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率的提升效果尤為明顯,僅需1 h,反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率即可從對照組的83.3%增加至98.3%,而且1 h的反應(yīng)時間也遠低于文獻報道的24 h。為了解釋添加劑提高全細胞催化反應(yīng)性能,應(yīng)用流式細胞術(shù)(flow cytometry,FCM)和紫外光譜分析來檢測不同添加劑對細胞膜通透性的影響。兩種方法的檢測結(jié)果與反應(yīng)數(shù)據(jù)相匹配,均可證明不同的添加劑確實對細胞膜存在不同的影響,適度增加膜的通透性可以很好的改善細胞催化反應(yīng)的效果。本論文建立了一個簡單、高效、環(huán)保且低成本的制備高光學(xué)純度(S)-NEMCA-HEPE的方法,具有潛在的工業(yè)化應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q78;TQ460.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 朱敦明;吳洽慶;;生物催化劑立體選擇性的基因工程改造[J];生物工程學(xué)報;2009年12期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 田雪梅;脂肪酶催化有機合成反應(yīng)的合理調(diào)控[D];吉林大學(xué);2016年

本文編號：2730303