【摘要】：MADS-box家族成員是一類廣泛存在于動物、植物和真菌的極其重要的調(diào)控因子,MADS-box蛋白都具有保守的MADS-box結構域。植物中MADS-box參與調(diào)控眾多生長發(fā)育過程,比如花器官的形成和果實的成熟等。番茄作為世界上廣泛種植的蔬菜作物,番茄的培育需要比較穩(wěn)定的生長發(fā)育條件。然而干旱、高鹽等環(huán)境脅迫嚴重影響了番茄的產(chǎn)量與品質。目前,學者對MADS-box基因參與番茄生長發(fā)育多集中在花與果實的研究中,然而對MADS-box基因影響番茄非生物脅迫響應的研究相對較少。因此,對此類MADS-box基因在番茄非生物脅迫中的功能研究顯得尤為必要。本研究從番茄中克隆出一個MADS-box基因SlMBP10,對其序列進行了生物信息學分析,并構建了該基因的沉默載體,通過農(nóng)桿菌轉化野生型番茄,以期研究番茄SlMBP10的功能。主要研究結果如下:(1)SlMBP10基因的生物信息學分析。本研究從番茄基因組數(shù)據(jù)庫獲得SlMBP10的cDNA序列。對SlMBP10編碼的氨基酸序列多序列比對和同源進化分析發(fā)現(xiàn),該基因屬于MIKC~C型MADS-box家族基因。對SlMBP10開放閱讀框上游3000bp啟動子序列分析,結果表明SlMBP10啟動子序列中含有多個脅迫相關的轉錄因子結合元件。(2)SlMBP10在野生型番茄不同組織中的表達分析。SlMBP10在營養(yǎng)器官(根、莖、葉)中表達量相對較高,其中莖部表達最高。同時,SlMBP10的激素和脅迫誘導性實驗表明,ABA等多種激素均能影響該基因的表達,NaCl和干旱脅迫能夠誘導該基因的表達,表明SlMBP10可能與番茄莖的生長發(fā)育、NaCl和干旱脅迫的響應有關。(3)SlMBP10轉基因番茄材料的獲得。根據(jù)SlMBP10的mRNA序列,設計特異引物,構建沉默表達載體并轉染野生型番茄。通過提取基因組DNA進行PCR陽性鑒定,獲得了轉基因陽性株系SlMBP10-RNAi。對其表型分析發(fā)現(xiàn),與野生型相比,SlMBP10-RNAi株系的花粉和果實發(fā)育等無明顯差異,然而SlMBP10-RNAi株系的莖沿莖縱軸方向出現(xiàn)開裂現(xiàn)象。結合上述相關非生物脅迫的表達模式分析,推測SlMBP10可能與非生物脅迫的應答有關,對番茄的營養(yǎng)生長和生殖生長各發(fā)育階段的調(diào)控影響并不大。(4)SlMBP10-RNAi株系T1代幼苗對NaCl和干旱抗性分析。對SlMBP10-RNAi幼苗高濃度鹽脅迫實驗發(fā)現(xiàn),SlMBP10-RNAi幼苗出現(xiàn)比野生型番茄萎蔫更早的表型。同時,與野生型相比,鹽脅迫處理后SlMBP10-RNAi株系葉片的葉綠素含量和相對含水量降低,MDA(丙二醛)含量顯著性上升,多個脅迫相關基因表達水平均顯著低于野生型,葉綠素合成相關基因表達受到影響。干旱脅迫處理SlMBP10-RNAi幼苗發(fā)現(xiàn),SlMBP10-RNAi幼苗的耐受性也比野生型番茄低,MDA含量顯著性上升,葉綠素含量、相對含水量以及多個脅迫相關基因表達水平均低于野生型,葉綠素合成相關基因表達受到影響。鹽水浸泡轉基因植株葉片實驗表明,SlMBP10-RNAi株系葉片葉綠素含量低于野生型。此外,NaCl敏感性實驗發(fā)現(xiàn)鹽處理對SlMBP10-RNAi株系幼苗生長的抑制作用更明顯。這些結果表明降低SlMBP10的表達水平可以減弱番茄抗鹽抗旱的能力。(5)SlMBP10-RNAi轉基因幼苗對三種激素的敏感性分析。ABA、IAA和GA_3的敏感性實驗發(fā)現(xiàn),ABA處理SlMBP10-RNAi和野生型幼苗后,轉基因幼苗的胚軸和根長均比野生型的減短。IAA、GA_3處理SlMBP10-RNAi和野生型幼苗后,轉基因幼苗胚軸和根長與野生型相比沒有明顯的差異。結果表明沉默SlMBP10基因提高了番茄幼苗對ABA的敏感性,而對IAA和GA_3的敏感性沒有明顯的影響。綜上所述,本研究從番茄中克隆了SlMBP10基因并對其在番茄幼苗非生物脅迫響應方面進行了初步的探索,為全面闡明SlMBP10基因的功能和其對非生物脅迫響應的分子機理奠定基礎。
【學位授予單位】：重慶大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;S641.2
【圖文】：

圖1.1 MADS-box蛋白結構和分類[42 44]Fig.1.1 Classification and structure of MADS-box proteins[42 44]MIKC型MADS-box基因的結構中主要包含四個結構域：M（MADS-boN端的MADS-box結構域，是MADS-box基因中最保守的部分，由50-60個基組成的，主要起與靶基因DNA結合的作用[45]，I（Intervening）即MAD域下游區(qū)域的I結構域，是由31-35個親水氨基酸組成，它與MADS-box結行使蛋白質二聚化的功能[46]，K（Keratin-like）結構域是植物中MADS-特有結構域，由大約70個氨基酸組成的含有3個α-螺旋結構的次級保守結參與蛋白與蛋白之間的相互作用[47]，C末端的C結構域（C-terminal）主要變化的疏水氨基酸組成，介導特異的MADS-box蛋白發(fā)揮不同的作用[48 5。MIKC型基因又可以分為MIKC*型和MIKCC型，兩者在I結構域存在差為止，對于MIKC*型MADS-box基因的研究尚不清楚，而MIKCC型基S-box基因家族中功能研究相對較清楚的，在植物的生長發(fā)育整個過程中作用。

1 緒 論5圖1.2 植物MIKC類MADS-box蛋白的結構[51]Fig.1.2 Domain structure of MIKC-type plant MADS-box protein[51]1.2.4 MADS-box 基因的功能MADS-box 轉錄因子在植物的所有器官的形態(tài)發(fā)生及植物生長發(fā)育的整個過程都有很重要的作用，例如根和葉片的生長[52]，花分生組織發(fā)育和控制開花時間[53]，花器官的發(fā)育[54]，果實成熟[55]，種子色素積累和胚胎發(fā)育以及對植物非生物脅迫的調(diào)控[56,57]。本節(jié)將對 MADS-box 基因在植物中的主要功能進行介紹：① 調(diào)控植物的營養(yǎng)生長目前已有研究表明 MADS-box 基因參與調(diào)控植物的營養(yǎng)生長。如 Tapia-Lopez等人[58]發(fā)現(xiàn)擬南芥 XAL1 基因的突變導致植株根的生長受到了抑制且有色素積累，根尖分生組織出現(xiàn)異常，細胞的擴增速度變慢。水稻 OsMDP1 基因會受到外源油菜素內(nèi)酯的抑制和黑暗的誘導而改變其轉錄水平

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本文編號：2728455