【摘要】：MADS-box家族成員是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和真菌的極其重要的調(diào)控因子,MADS-box蛋白都具有保守的MADS-box結(jié)構(gòu)域。植物中MADS-box參與調(diào)控眾多生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程,比如花器官的形成和果實(shí)的成熟等。番茄作為世界上廣泛種植的蔬菜作物,番茄的培育需要比較穩(wěn)定的生長(zhǎng)發(fā)育條件。然而干旱、高鹽等環(huán)境脅迫嚴(yán)重影響了番茄的產(chǎn)量與品質(zhì)。目前,學(xué)者對(duì)MADS-box基因參與番茄生長(zhǎng)發(fā)育多集中在花與果實(shí)的研究中,然而對(duì)MADS-box基因影響番茄非生物脅迫響應(yīng)的研究相對(duì)較少。因此,對(duì)此類MADS-box基因在番茄非生物脅迫中的功能研究顯得尤為必要。本研究從番茄中克隆出一個(gè)MADS-box基因SlMBP10,對(duì)其序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,并構(gòu)建了該基因的沉默載體,通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化野生型番茄,以期研究番茄SlMBP10的功能。主要研究結(jié)果如下:(1)SlMBP10基因的生物信息學(xué)分析。本研究從番茄基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得SlMBP10的cDNA序列。對(duì)SlMBP10編碼的氨基酸序列多序列比對(duì)和同源進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),該基因?qū)儆贛IKC~C型MADS-box家族基因。對(duì)SlMBP10開放閱讀框上游3000bp啟動(dòng)子序列分析,結(jié)果表明SlMBP10啟動(dòng)子序列中含有多個(gè)脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件。(2)SlMBP10在野生型番茄不同組織中的表達(dá)分析。SlMBP10在營(yíng)養(yǎng)器官(根、莖、葉)中表達(dá)量相對(duì)較高,其中莖部表達(dá)最高。同時(shí),SlMBP10的激素和脅迫誘導(dǎo)性實(shí)驗(yàn)表明,ABA等多種激素均能影響該基因的表達(dá),NaCl和干旱脅迫能夠誘導(dǎo)該基因的表達(dá),表明SlMBP10可能與番茄莖的生長(zhǎng)發(fā)育、NaCl和干旱脅迫的響應(yīng)有關(guān)。(3)SlMBP10轉(zhuǎn)基因番茄材料的獲得。根據(jù)SlMBP10的mRNA序列,設(shè)計(jì)特異引物,構(gòu)建沉默表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染野生型番茄。通過(guò)提取基因組DNA進(jìn)行PCR陽(yáng)性鑒定,獲得了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系SlMBP10-RNAi。對(duì)其表型分析發(fā)現(xiàn),與野生型相比,SlMBP10-RNAi株系的花粉和果實(shí)發(fā)育等無(wú)明顯差異,然而SlMBP10-RNAi株系的莖沿莖縱軸方向出現(xiàn)開裂現(xiàn)象。結(jié)合上述相關(guān)非生物脅迫的表達(dá)模式分析,推測(cè)SlMBP10可能與非生物脅迫的應(yīng)答有關(guān),對(duì)番茄的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)各發(fā)育階段的調(diào)控影響并不大。(4)SlMBP10-RNAi株系T1代幼苗對(duì)NaCl和干旱抗性分析。對(duì)SlMBP10-RNAi幼苗高濃度鹽脅迫實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),SlMBP10-RNAi幼苗出現(xiàn)比野生型番茄萎蔫更早的表型。同時(shí),與野生型相比,鹽脅迫處理后SlMBP10-RNAi株系葉片的葉綠素含量和相對(duì)含水量降低,MDA(丙二醛)含量顯著性上升,多個(gè)脅迫相關(guān)基因表達(dá)水平均顯著低于野生型,葉綠素合成相關(guān)基因表達(dá)受到影響。干旱脅迫處理SlMBP10-RNAi幼苗發(fā)現(xiàn),SlMBP10-RNAi幼苗的耐受性也比野生型番茄低,MDA含量顯著性上升,葉綠素含量、相對(duì)含水量以及多個(gè)脅迫相關(guān)基因表達(dá)水平均低于野生型,葉綠素合成相關(guān)基因表達(dá)受到影響。鹽水浸泡轉(zhuǎn)基因植株葉片實(shí)驗(yàn)表明,SlMBP10-RNAi株系葉片葉綠素含量低于野生型。此外,NaCl敏感性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鹽處理對(duì)SlMBP10-RNAi株系幼苗生長(zhǎng)的抑制作用更明顯。這些結(jié)果表明降低SlMBP10的表達(dá)水平可以減弱番茄抗鹽抗旱的能力。(5)SlMBP10-RNAi轉(zhuǎn)基因幼苗對(duì)三種激素的敏感性分析。ABA、IAA和GA_3的敏感性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ABA處理SlMBP10-RNAi和野生型幼苗后,轉(zhuǎn)基因幼苗的胚軸和根長(zhǎng)均比野生型的減短。IAA、GA_3處理SlMBP10-RNAi和野生型幼苗后,轉(zhuǎn)基因幼苗胚軸和根長(zhǎng)與野生型相比沒有明顯的差異。結(jié)果表明沉默SlMBP10基因提高了番茄幼苗對(duì)ABA的敏感性,而對(duì)IAA和GA_3的敏感性沒有明顯的影響。綜上所述,本研究從番茄中克隆了SlMBP10基因并對(duì)其在番茄幼苗非生物脅迫響應(yīng)方面進(jìn)行了初步的探索,為全面闡明SlMBP10基因的功能和其對(duì)非生物脅迫響應(yīng)的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q943.2;S641.2
【圖文】：

圖1.1 MADS-box蛋白結(jié)構(gòu)和分類[42 44]Fig.1.1 Classification and structure of MADS-box proteins[42 44]MIKC型MADS-box基因的結(jié)構(gòu)中主要包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域：M（MADS-boN端的MADS-box結(jié)構(gòu)域，是MADS-box基因中最保守的部分，由50-60個(gè)基組成的，主要起與靶基因DNA結(jié)合的作用[45]，I（Intervening）即MAD域下游區(qū)域的I結(jié)構(gòu)域，是由31-35個(gè)親水氨基酸組成，它與MADS-box結(jié)行使蛋白質(zhì)二聚化的功能[46]，K（Keratin-like）結(jié)構(gòu)域是植物中MADS-特有結(jié)構(gòu)域，由大約70個(gè)氨基酸組成的含有3個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)的次級(jí)保守結(jié)參與蛋白與蛋白之間的相互作用[47]，C末端的C結(jié)構(gòu)域（C-terminal）主要變化的疏水氨基酸組成，介導(dǎo)特異的MADS-box蛋白發(fā)揮不同的作用[48 5。MIKC型基因又可以分為MIKC*型和MIKCC型，兩者在I結(jié)構(gòu)域存在差為止，對(duì)于MIKC*型MADS-box基因的研究尚不清楚，而MIKCC型基S-box基因家族中功能研究相對(duì)較清楚的，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育整個(gè)過(guò)程中作用。

1 緒 論5圖1.2 植物MIKC類MADS-box蛋白的結(jié)構(gòu)[51]Fig.1.2 Domain structure of MIKC-type plant MADS-box protein[51]1.2.4 MADS-box 基因的功能MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子在植物的所有器官的形態(tài)發(fā)生及植物生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)過(guò)程都有很重要的作用，例如根和葉片的生長(zhǎng)[52]，花分生組織發(fā)育和控制開花時(shí)間[53]，花器官的發(fā)育[54]，果實(shí)成熟[55]，種子色素積累和胚胎發(fā)育以及對(duì)植物非生物脅迫的調(diào)控[56,57]。本節(jié)將對(duì) MADS-box 基因在植物中的主要功能進(jìn)行介紹：① 調(diào)控植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)目前已有研究表明 MADS-box 基因參與調(diào)控植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。如 Tapia-Lopez等人[58]發(fā)現(xiàn)擬南芥 XAL1 基因的突變導(dǎo)致植株根的生長(zhǎng)受到了抑制且有色素積累，根尖分生組織出現(xiàn)異常，細(xì)胞的擴(kuò)增速度變慢。水稻 OsMDP1 基因會(huì)受到外源油菜素內(nèi)酯的抑制和黑暗的誘導(dǎo)而改變其轉(zhuǎn)錄水平

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2728455