【摘要】：目的:急性腎損傷(AKI)是暴發(fā)性肝衰竭(FHF)患者一種常見的并發(fā)癥,因合并腎功能及肝功能衰竭,預(yù)后極差。其機制尚不完全清楚,可能與血流動力學(xué)的改變、腎臟血液灌注不足、交感神經(jīng)活化和血管活性物質(zhì)合成增加相關(guān),最終導(dǎo)致腎血管收縮進(jìn)而引起腎小球濾過率(GFR)顯著降低。我們先前的研究證實FHF大鼠伴有肌酐(Cr)的明顯上升及1,4,5-trisphosphate 1型受體(IP_3R1)蛋白表達(dá)明顯增加,其上調(diào)時相與血中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、內(nèi)皮素-1(ET-1)升高時相一致,TNF-α抗體預(yù)先阻斷后可明顯改善腎功能及GFR。該結(jié)果說明TNF-α在FHF大鼠GFR減少中起了至關(guān)重要的作用。我們另一個研究結(jié)果結(jié)果揭示TNF-α是通過TNFR1/PC-PLC/PKC-α和TNFR2獨立的兩條信號通路上調(diào)IP_3R1表達(dá)的。TNF-α孵育GMCs后檢測其對胞漿Ca~(2+)濃度([Ca~(2+)]i)、PKC-α蛋白及mRNA、IP_3R1蛋白及mRNA、SP-1蛋白表達(dá)水平及SP-1蛋白與IP_3R1啟動子結(jié)合程度的影響,探討TNF-α在其中的作用。設(shè)計、合成并篩選針對PKC-α基因的siRNA,觀察PKC-α沉默后對TNF-α誘導(dǎo)IP_3R1、PKC-α、SP-1表達(dá)及對胞漿Ca~(2+)濃度SP-1蛋白與IP_3R1啟動子結(jié)合的影響。根據(jù)篩選出的siRNA序列包裝合成靶向PKC-α的重組慢病毒載體,應(yīng)用D-氨基半乳糖(D-Gal N)/脂多糖(LPS)構(gòu)建FHF大鼠AKI模型,檢測血清生化學(xué)及細(xì)胞因子改變。采用微滲泵植入方法,以FITC-Inulin作為標(biāo)記物測定GFR,并檢測腎小球([Ca~(2+)]i)變化及腎臟組織中PKC-α蛋白及mRNA、IP_3R1蛋白及IP_3R1 mRNA表達(dá)。進(jìn)一步明確TNF-α-PKC-α在FHF合并急性腎功能衰竭中的作用及其下游的細(xì)胞通路,以及阻斷PKC-α對腎功及GFR的改善情況。研究方法1.細(xì)胞培養(yǎng)、傳代和siRNA-PKC-α轉(zhuǎn)染。大鼠腎小球系膜細(xì)胞(HBZY-1)細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代5次后,以2×10~5cells/孔鋪6孔板,培養(yǎng)過夜,16h后進(jìn)行siRNA-PKC-α轉(zhuǎn)染。3條siRNA-PKC-α及陰性對照siRNA按2.5μl(50pmol)、5μl(100pmol)及7.5μl(150pmol)分別和與2.5μl,5μl,7.5μl Lipofectamine?RNAi MAX Reagent在0.5ml雙無DMEM培養(yǎng)基中混勻后室溫孵育15min;六孔板中每孔加雙無DMED高糖培養(yǎng)基2ml,再向每孔加入siRNA與Lipofectamine?RNAi MAX Reagent混合液0.5ml。5%CO_2孵箱37℃培養(yǎng)4-6h后將無血清培養(yǎng)基換成含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48或24小時,收集細(xì)胞,分別提取RNA和蛋白。2.Real-time PCR、Western blot方法分別檢測PKC-αmRNA及其蛋白的表達(dá)。根據(jù)表達(dá)結(jié)果選擇最優(yōu)siRNA序列。3.TNF-α(100mg/ml)分別孵育0、2、4、8、24小時,分別檢測TNF-α對PKC-α、IP_3R1 mRNA及蛋白的表達(dá)的影響。4.將篩選出的siRNA和陰性對照siRNA分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),檢測轉(zhuǎn)染后對TNF-α誘導(dǎo)PKC-α、IP_3R1 mRNA及蛋白的表達(dá)的影響。5.將篩選出的siRNA和陰性對照siRNA分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),檢測轉(zhuǎn)染后對TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)釋放增加的影響。6.TNF-α(100mg/ml)分別孵育0、2、4、8、24小時,檢測TNF-α對SP-1蛋白表達(dá)的影響,同時Ch IP檢測SP-1與IP_3R1 promoter結(jié)合的情況。7.將篩選出的siRNA和陰性對照siRNA分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),觀察敲減PKC-α后對SP-1蛋白表達(dá)的影響,Ch IP檢測對SP-1與IP_3R1 promoter結(jié)合的影響。8.TNF-α(100mg/ml)分別孵育0、2、4、8、24小時,分別檢測TNF-α對JNK、p-JNK蛋白表達(dá)的影響。9.將篩選出的siRNA和陰性對照siRNA分別轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),檢測轉(zhuǎn)染后對TNF-α誘導(dǎo)JNK、p-JNK蛋白表達(dá)的影響。10.應(yīng)用JNK抑制劑SP600125預(yù)處理后觀察對SP-1蛋白表達(dá)及對IP_3R1 mRNA及蛋白的表達(dá)的影響。11.根據(jù)siRNA條帶篩選結(jié)果構(gòu)建慢病毒重組表達(dá)載體。12.驗證動物體內(nèi)慢病毒介導(dǎo)PKC-α基因的敲減效率。尾靜脈注入慢病毒重組表達(dá)載體LV-sh RNA-PKC-α(NM_001105713.1-siRNA-487)1.0×10~8TU/只,2周后檢測腎臟組織PKC-αmRNA及其蛋白的表達(dá),制作腎臟組織冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在組織內(nèi)的表達(dá),測定慢病毒在大鼠體內(nèi)PKC-α敲減效率的情況。13.構(gòu)建FHF合并AKI模型:給藥造模前2周,LV-sh RNA-NC組及LV-sh RNA-PKC-α組各10只大鼠,分別尾靜脈注射慢病毒空質(zhì)粒及LV-sh RNA-PKC-α100μl(1×10~8TU/ml),用生理鹽水(NS)稀釋至500μl。1周后將所有SD大鼠植入充滿FITC-Inulin的微滲透泵。2周后所有SD大鼠稱重并按不同分組給藥,NS組給生理鹽水;G/L組、LV-NC組和LV-PKC-α組給D-Gal N(400mg/kg)/LPS(32μg/kg)的生理鹽水溶液;給藥體積均為2ml/kg。所有大鼠給藥后移入代謝籠搜集尿液。14.肝臟組織常規(guī)HE染色,光鏡下觀察肝細(xì)胞壞死情況;腎臟組織常規(guī)HE染色,光鏡下觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變;電鏡下觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變。15.檢測血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、鉀離子(K~+)、鈉離子(Na~+)及氯離子(Cl~-)及細(xì)胞因子(TNF-α和ET-1)。16.應(yīng)用熒光酶標(biāo)儀測定血清FITC熒光量,根據(jù)公式GFR=R/[Iss]計算GFR,GFR1(ml·min~(-1));GFR2(ml·min~(-1)·kgB W~(-1)),GFR3(ml·min~(-1)·gKB W~(-1)),觀察沉默PKC-α對GFR的影響。17.Real-time PCR、Western blot方法檢測各組大鼠腎臟組織PKC-α、IP_3R1mRNA及其蛋白的表達(dá)情況,研究敲減PKC-α后對腎臟IP_3R1表達(dá)的影響。18.分離腎小球,檢測各組大鼠腎小球內(nèi)Ca~(2+)離子濃度變化,研究敲減PKC-α后對腎臟組織細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)離子濃度變化的影響。19.分離腎小球,檢測各組大鼠腎小球容積的變化,研究敲減PKC-α后對腎臟組織細(xì)胞收縮的影響。20.收集尿液,檢測大鼠尿液總蛋白、尿微量白蛋白(MAU/ALB)及N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)表達(dá)。結(jié)果:1.根據(jù)3條siRNA在不同轉(zhuǎn)染條件下mRNA及蛋白敲減效率的不同,選擇一條最優(yōu)序列,并委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司包裝為重組LV-sh RNA-PKC-α慢病毒包裝質(zhì)粒。2.TNF-α處理組IP_3R1 mRNA表達(dá)相比0h顯著增加,2h到8h IP_3R1mRNA逐漸穩(wěn)定增加,并于8h達(dá)高峰(P0.05)。TNF-α處理組IP_3R1蛋白表達(dá)相比0h顯著增加,至24h IP_3R1蛋白升高達(dá)高峰,統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P0.05)。3.TNF-α處理組PKC-αmRNA的表達(dá)相比0h顯著增加,4h到8h PKC-αmRNA穩(wěn)定逐漸增加,于8h達(dá)高峰并維持高表達(dá)至24h(P0.05)。TNF-α處理組PKC-α蛋白的表達(dá)相比0h顯著增加,2h開始升高,至8h PKC-α蛋白升高達(dá)高峰,統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P0.05)。4.單純敲減PKC-α基因?qū)P_3R1蛋白及mRNA的表達(dá)的影響不大,但對比陰性對照轉(zhuǎn)染組TNF-α孵育8h及24h組,PKC-α基因敲減組的IP_3R1mRNA及蛋白的表達(dá)明顯下降。5.TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)釋放增加,單純敲減PKC-α基因?qū)?xì)胞內(nèi)Ca~(2+)釋放沒有明顯影響,但可明顯抑制由TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)釋放。6.TNF-α處理組SP-1蛋白的表達(dá)相比0h顯著增加,2h到8h SP-1蛋白逐漸穩(wěn)定增加,于8h達(dá)高峰(P0.05)。TNF-α處理組SP-1蛋白與IP_3R1promoter結(jié)合相比0h明顯增加,于8h達(dá)高峰。7.單純敲減PKC-α基因?qū)P-1的表達(dá)的影響不大,但可明顯抑制由TNF-α誘導(dǎo)的SP-1表達(dá)增加。且可以明顯抑制SP-1蛋白及與IP_3R1 promoter的結(jié)合。8.TNF-α處理組JNK及p-JNK蛋白的表達(dá)相比0h顯著增加,2h到8h逐漸增加,于8h達(dá)高峰,統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(P0.05)。9.單純敲減PKC-α對JNK及p-JNK蛋白的表達(dá)的影響不大,但可明顯著抑制由TNF-α誘導(dǎo)的JNK及p-JNK蛋白表達(dá)增加。10.SP600125預(yù)處理后可顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的SP-1蛋白及IP_3R1mRNA及蛋白的表達(dá)增加。11.冰凍切片顯示綠色熒光蛋白密集分布于細(xì)胞內(nèi)。根據(jù)Western blot、Real-time PCR結(jié)果,敲減效率接近50%。12.肉眼觀察D-Gal N/LPS聯(lián)合給藥后12h肝臟呈紫紅色,充血腫脹,彌漫出血點。光鏡下觀察肝細(xì)胞條索斷裂,小葉結(jié)構(gòu)不清,肝血竇擴張,肝細(xì)胞核溶解碎裂,見大量核碎屑,肝細(xì)胞核固縮,kuffer細(xì)胞增生。光鏡、電鏡下觀察腎小球、近曲小管、遠(yuǎn)曲小管結(jié)構(gòu)均正常。13.D-Gal N/LPS組及LV-sh RNA-NC組ALT、AST、BUN、Cr、TNF-α、ET-1均在給藥后12h明顯升高,與對照組相比有顯著性差異(P0.05)。LV-sh RNA-PKC-α組的Cr、BUN水平與D-Gal N/LPS組及LV-sh RNA-NC組比較均明顯降低,有顯著性差異(P0.05),但ALT較兩組相比無顯著性差異(P0.05)。K~+、Na~+、Cl~-濃度無明顯變化。14.D-Gal N/LPS組、LV-sh RNA-NC組對比NS組12小時GFR顯著降低,有顯著性差異(P0.05)。D-Gal N/LPS組、LV-sh RNA-NC組相比12小時GFR沒有顯著差異(P0.05)。LV-sh RNA-PKC-α組12小時GFR與D-Gal N/LPS組及LV-sh RNA-NC組相比較明顯增加,有顯著性差異(P0.05),與NS對照組比較,校正后的GFR(GFR2,GFR3)比校正前(GFR1)更接近正常水平。15.D-Gal N/LPS組及LV-sh RNA-NC組12小時IP_3R1蛋白呈高水平表達(dá),兩者之間無顯著性差異(P0.05);而LV-sh RNA-PKC-α組IP_3R1蛋白表達(dá)明顯減少,與D-Gal N/LPS組及LV-sh RNA-NC組比具有顯著性(P0.05)。16.D-Gal N/LPS組及LV-sh RNA-NC組12小時腎小球內(nèi)Ca~(2+)離子濃度在ET-1刺激后對比基線值比值明顯升高,兩者之間無顯著性差異(P0.05);而LV-sh RNA-PKC-α組ET-1刺激后Ca~(2+)離子濃度與基線比值與D-Gal N/LPS組及LV-sh RNA-NC組相比顯著降低,具有顯著性(P0.05)。17.D-Gal N/LPS組及LV-sh RNA-NC組12小時腎小球容積明顯降低,兩者之間無顯著性差異(P0.05);而LV-sh RNA-PKC-α組腎小球容積明顯改善,與D-Gal N/LPS組及LV-sh RNA-NC組比具有顯著性(P0.05)。18.各組間大鼠尿液總蛋白、尿微量白蛋白(MAU/ALB)及N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)結(jié)果無顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:1.TNF-α可誘導(dǎo)GMCs中IP_3R1表達(dá)的顯著上調(diào),且IP_3R1 mRNA的轉(zhuǎn)錄先于IP_3R1蛋白的翻譯,該結(jié)果說明TNF-α可在基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控IP_3R1的表達(dá)。2.TNF-α處理的GMCs中,PKC-α蛋白及mRNA的表達(dá)明顯增強,并與TNF-α上調(diào)IP_3R1蛋白表達(dá)密切相關(guān)。3.敲減PKC-α可以明顯抑制GMCs細(xì)胞內(nèi)由TNF-α誘導(dǎo)的IP_3R1蛋白及mRNA的表達(dá)。4.敲減PKC-α可以明顯抑制GMCs細(xì)胞內(nèi)由TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)釋放增加。5.TNF-α處理GMCs后,SP-1蛋白的表達(dá)明顯增強,且與IP_3R1promoter的結(jié)合明顯增強。6.敲減PKC-α可以明顯抑制GMCs細(xì)胞內(nèi)由TNF-α誘導(dǎo)的SP-1蛋白的表達(dá)及與IP_3R1 promoter的結(jié)合。7.TNF-α處理GMCs后JNK/p-JNK蛋白的表達(dá)明顯增強,而敲減PKC-α可以明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的JNK/p-JNK蛋白的表達(dá)增強。8.應(yīng)用JNK抑制劑可以明顯抑制TNF-α誘導(dǎo)的SP-1蛋白及IP_3R1mRNA及蛋白的表達(dá)。9.D-Gal N/LPS預(yù)處理SD大鼠12h后肝細(xì)胞嚴(yán)重壞死,Cr顯著升高,GFR顯著下降。在動物水平模擬了人暴發(fā)性肝衰竭發(fā)生急性腎損傷的部分病理生理過程。10.預(yù)先注入靶向PKC-α基因的重組慢病毒載體可以明顯改善大鼠腎功,并部分改善大鼠GFR。11.預(yù)先注入靶向PKC-α基因的重組慢病毒載體可以明顯抑制肝壞死大鼠腎臟IP_3R1蛋白及mRNA的表達(dá)。12.預(yù)先注入靶向PKC-α基因的重組慢病毒載體可以明顯降低ET-1刺激后Ca~(2+)離子濃度與基線比值。13.預(yù)先注入靶向PKC-α基因的重組慢病毒載體可以明顯改善腎小球容積。
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R575.3
【圖文】：

10 1，siRNA-PKC-α 敲減 mRNA 效率檢測（n=3）。A， 敲減 24 小時 PKC-α mRNA 表達(dá)況。B，敲減 48 小時 PKC-α mRNA 表達(dá)情況。（* P<0.05 vs siRNA-NC）.2 Western Blot 分析 siRNA 敲減效率各組 80KD 處均可見特異性 PKC-α 蛋白條帶，42KD 處內(nèi)參 β-actin 蛋白。瞬轉(zhuǎn)后 24h 及 48h 不同濃度不同條組帶敲減效率分別為（圖 2A，B），選減效率超過 50%以下序列。根據(jù)結(jié)果，綜合選擇 NM_001105713.1_siRNA_4帶繼續(xù)下一步實驗。

11圖 2，siRNA-PKC-α 敲減蛋白效率檢測（n=3）。A，敲減 24 小時 PKC-α 蛋白表達(dá)情況。B，敲減 48 小時 PKC-α 蛋白表達(dá)情況。（* P<0.05 vs siRNA-NC）3.3 Real Time PCR 分析 IP3R1、PKC-α mRNA 表達(dá)情況TNF-α 處理組與對照組（1.00±0.15）相比 IP3R1 mRNA 的表達(dá)明顯增加，2h開始升高（1.18±0.52，P=0.455）, 4h 繼續(xù)上升（1.48±0.80，P=0.059），以 8h 最為明顯（2.22±0.53，P=0.000），24h mRNA（1.04±0.08，P=0.88）表達(dá)回落接近

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2727741