【摘要】：【目的】草甘膦是世界上用途最廣的除草劑之一,磷是玉米生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素,培育抗草甘膦兼具高效磷素吸收利用的復(fù)合性狀對玉米生產(chǎn)有重要意義.【方法】構(gòu)建由Ubiquitin1啟動子驅(qū)動的兩種葉綠體轉(zhuǎn)運肽/CP4 EPSPs融合基因,和根特異性啟動子GLU1P驅(qū)動的植酸酶基因phyA2雙價植物表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對玉米莖尖進(jìn)行轉(zhuǎn)化.對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行實時定量PCR(RT-qPCR)分析、不同濃度草甘膦檢測以及丙酮-磷鉬酸銨法測定.【結(jié)果】獲得9株陽性轉(zhuǎn)基因植株;發(fā)現(xiàn)不同轉(zhuǎn)運肽對EPSPs基因的表達(dá)量影響不同,且對草甘膦的抗性也不同;轉(zhuǎn)基因植株植酸酶活性比野生型植株平均提高18.7倍.【結(jié)論】本研究為獲得具有草甘膦抗性和磷素高效吸收利用復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因玉米優(yōu)良種質(zhì)奠定了基礎(chǔ).
【圖文】：

收目的片段，用Ｔ４ＤＮＡ連接酶連接，獲得重組子ｐＣＥ－ＮＧＣ和ｐＣＥ－ＮＧＭ；再用ＥｃｏｒＲⅠ和ＳａｃⅠ分別酶切ｐＭＤ－ＵＢＩ、ｐＣＥ－ＮＧＣ和ｐＣＥ－ＮＧＭ，回收目的片段，用Ｔ４ＤＮＡ連接酶連接，獲得重組子ｐＣＥ－ＮＧＣ２和ｐＣＥ－ＮＧＭ２；最后用ＸｍａⅠ分別酶切ｐＣＥ－ＮＧＣ２和ｐＣＥ－ＮＧＭ２，用Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ無縫連接技術(shù)將ｐｈｙＡ２基因連入，獲得重組子ｐＣＥ－ＮＧＣ３和ｐＣＥ－ＮＧＭ３．圖１ｐＣＥ－ＮＧＣ３表達(dá)載體結(jié)構(gòu)Ｆｉｇｕｒｅ１ＣｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｐＣＥ－ＮＧＣ３ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ圖２ｐＣＥ－ＮＧＭ３表達(dá)載體結(jié)構(gòu)Ｆｉｇｕｒｅ２ＣｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｐＣＥ－ＮＧＭ３ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ采用ＣａＣｌ２凍融法［２８］分別將２種重組植物表達(dá)載體ｐＣＥ－ＮＧＣ３和ｐＣＥ－ＮＧＭ３導(dǎo)入農(nóng)桿菌ＥＨＡ１０５感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞均勻涂布于含卡那霉素和利福平的ＹＥＰ固體培養(yǎng)基，２８℃暗培養(yǎng)２８～３０ｈ，挑取單菌落接種到含上述抗生素的ＹＥＰ液體培養(yǎng)基，２８℃震蕩培養(yǎng)２８ｈ左右，提取質(zhì)粒，用特異性引物Ｕ１／Ｕ２進(jìn)行ＰＣＲ鑒定，并保存農(nóng)桿菌工程菌用于植物轉(zhuǎn)化．１．６農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化及鑒定挑選飽滿的玉米自交系種子，用７０％的乙醇浸泡８ｍｉｎ，然后用０．１％的升汞浸泡６ｍｉｎ，再用無菌水沖洗４次，然后用無菌水室溫浸泡４～６ｈ，再

ＢＩ、ｐＣＥ－ＮＧＣ和ｐＣＥ－ＮＧＭ，回收目的片段，用Ｔ４ＤＮＡ連接酶連接，獲得重組子ｐＣＥ－ＮＧＣ２和ｐＣＥ－ＮＧＭ２；最后用ＸｍａⅠ分別酶切ｐＣＥ－ＮＧＣ２和ｐＣＥ－ＮＧＭ２，用Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ無縫連接技術(shù)將ｐｈｙＡ２基因連入，獲得重組子ｐＣＥ－ＮＧＣ３和ｐＣＥ－ＮＧＭ３．圖１ｐＣＥ－ＮＧＣ３表達(dá)載體結(jié)構(gòu)Ｆｉｇｕｒｅ１ＣｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｐＣＥ－ＮＧＣ３ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ圖２ｐＣＥ－ＮＧＭ３表達(dá)載體結(jié)構(gòu)Ｆｉｇｕｒｅ２ＣｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｐＣＥ－ＮＧＭ３ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ采用ＣａＣｌ２凍融法［２８］分別將２種重組植物表達(dá)載體ｐＣＥ－ＮＧＣ３和ｐＣＥ－ＮＧＭ３導(dǎo)入農(nóng)桿菌ＥＨＡ１０５感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞均勻涂布于含卡那霉素和利福平的ＹＥＰ固體培養(yǎng)基，２８℃暗培養(yǎng)２８～３０ｈ，挑取單菌落接種到含上述抗生素的ＹＥＰ液體培養(yǎng)基，２８℃震蕩培養(yǎng)２８ｈ左右，提取質(zhì)粒，用特異性引物Ｕ１／Ｕ２進(jìn)行ＰＣＲ鑒定，并保存農(nóng)桿菌工程菌用于植物轉(zhuǎn)化．１．６農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化及鑒定挑選飽滿的玉米自交系種子，用７０％的乙醇浸泡８ｍｉｎ，然后用０．１％的升汞浸泡６ｍｉｎ，再用無菌水沖洗４次，然后用無菌水室溫浸泡４～６ｈ，再用升汞消毒１０ｍｉｎ，無菌水沖洗５次，２８℃黑暗條件下萌發(fā)．發(fā)芽后轉(zhuǎn)到萌發(fā)培養(yǎng)基上繼續(xù)生長，待苗長至４ｃｍ高時，剝?nèi)ヅ哐壳屎?

【參考文獻(xiàn)】

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【二級參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2721549