【摘要】：柑橘黃龍病(Huanglongbing,HLB)是世界性的柑橘檢疫性病害,其病原菌為韌皮桿菌屬(Liberibacter)的革蘭氏陰性細菌,其中亞洲種(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)是黃龍病的主要致病變種。植物應對病原菌侵染防御機制中關鍵步驟是通過激活植物局部獲得性抗性(Local acquired resistance,LAR)進一步引起系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic acquired resistance,SAR),這一過程的核心激活信號為水楊酸(Salicylic acid,SA)。植株產生SAR需要SA信號分子的誘導和長距離信號分子水楊酸甲酯(Methyl salicylate,MeSA)的傳遞,水楊酸羧基甲基轉移酶(Salicylic acid carboxyl methyltransferase,SAMT)是SA和MeSA之間轉化的關鍵紐帶,能催化SA甲基化為MeSA。有研究表明SA介導的抗性反應在柑橘黃龍病抗性中起著重要作用,但其確切的作用機制未見報道。為了探討水楊酸信號途徑調控柑橘黃龍病抗性的相關機制,本研究以酸柚和錦橙為試材,從癥狀表現(xiàn)、病原菌生長、寄主解剖結構變化、SA和MeSA水平等方面詳細研究了兩種柑桔抗性差異的可能原因,結果發(fā)現(xiàn)MeSA信號與品種抗性緊密相關,在此基礎上,對產生MeSA信號的關鍵基因CsSAMT-1進行了深入的研究。具體的研究結果如下:1、酸柚和錦橙對黃龍病耐性差異分析對酸柚和錦橙進行黃龍病耐性評價發(fā)現(xiàn),酸柚感染黃龍病后發(fā)病所需時間較錦橙長,感病后癥狀較錦橙輕,顯癥所需菌量較錦橙多,感病后淀粉粒和胼胝質積累量則少于錦橙,韌皮部加厚程度也明顯小于錦橙,結果表明酸柚較錦橙具有一定的黃龍病耐受性。2、酸柚和錦橙感病前后SA、MeSA水平差異利用HPLC-MS/MS法測定感病前后兩種物質含量發(fā)現(xiàn),對照組中,酸柚葉脈SA和MeSA含量分別為9.02 ng·g~(-1)(FW)和12.33 ng·g~(-1)(FW),均顯著高于錦橙(1.86 ng·g~(-1)和0.04 ng·g~(-1),FW)。感染HLB后,錦橙中SA和MeSA含量均小幅升高,特別是葉脈中SA的含量增加了10.58倍(至19.69 ng·g~(-1),FW);相反,酸柚感染HLB后葉脈SA含量急劇下降(至3.74 ng·g~(-1),FW),MeSA含量則小幅升高(至16.02 ng·g~(-1),FW)。感病后錦橙中MeSA含量雖有一定程度上升(至0.51 ng·g~(-1),FW),但仍遠少于酸柚中MeSA含量,且低于酸柚對照中MeSA水平。實驗結果表明:耐病酸柚對照中SA和MeSA含量均顯著高于易感錦橙,且HLB侵染后錦橙中MeSA的積累仍遠低于酸柚。由此推測,酸柚對黃龍病有較高耐受性可能與其體內大量的MeSA有關。3、酸柚和錦橙感病前后CsSAMT-1基因的表達差異定量PCR分析黃龍病侵染后CsSAMT-1基因的相對表達水平發(fā)現(xiàn),與對照植株相比,錦橙在HLB誘導下CsSAMT-1的表達水平明顯上升,且在葉脈中相對表達量顯著高于葉肉;酸柚在HLB誘導下CsSAMT-1表達水平上升趨勢則不明顯。進一步分析發(fā)現(xiàn),感染HLB前,酸柚葉肉和葉脈中CsSAMT-1的表達量分別是錦橙的194.56倍和57.16倍;感染HLB后,下降為4.08倍和5.48倍,但仍高于錦橙。結果表明,CsSAMT-1在高感錦橙中受HLB誘導上調表達,在耐病酸柚中CsSAMT-1并不受HLB誘導顯著上調,而是呈初始高水平表達,在感病前其表達水平就已顯著高于錦橙。由此推測,CsSAMT-1基因的高表達在柑橘對抗黃龍病侵染中有著重要作用。4、外施SA和MeSA誘導酸柚及錦橙CsSAMT-1基因表達分析在SA、MeSA誘導下,錦橙和酸柚中CsSAMT-1基因的表達水平均上調。錦橙在SA、MeSA處理下CsSAMT-1表達水平均于12 h達到最高,酸柚均在處理6 h后達到最高,且6 h時酸柚中CsSAMT-1的表達量高于錦橙。結果表明酸柚響應SA和MeSA誘導CsSAMT-1表達較錦橙早。5、CsSAMT-1基因的克隆和生物信息學分析分別用感染黃龍病的酸柚和錦橙對CsSAMT-1基因進行PCR擴增,測序分析表明該基因的開放閱讀框為1 113 bp,編碼370個氨基酸,第42-370位氨基酸之間有一典型Methyltransf_7甲基轉移酶保守域,以SAM為甲基供體,作用底物之一為水楊酸。其一級結構為親水性穩(wěn)定蛋白,進化分析表明與可可、棉花的SAMT親緣關系較近。6、超量和干擾表達CsSAMT-1的轉基因錦橙表型分析以CaMV35S為啟動子,構建了CsSAMT-1基因超量表達和RNAi干擾載體,并遺傳轉化錦橙上胚軸,經GUS染色和PCR鑒定,共得到超表達CsSAMT-1的轉基因植株16株,RNAi干擾轉基因植株4株。與對照相比,在嫁接成活早期超表達轉基因植株的葉形較圓、葉色較綠、葉片較厚,而干擾表達轉基因植株則表現(xiàn)為葉色較淺、葉片較厚,但隨著植株的生長這種葉色和葉形差異基本消失。對大部分轉基因植株葉片的長度和寬度測量分析,結果表明與對照植株無顯著差異,而幾乎全部轉基因植株的葉片顯著厚于對照植株。7、轉基因錦橙CsSAMT-1基因表達和SA、MeSA水平的分析超量表達CsSAMT-1的轉基因植株,基因表達水平較對照植株顯著上調,SA和MeSA含量也較對照明顯升高,說明CsSAMT-1的超量表達促進了SA向MeSA的正向轉化積累,并在非侵染部進一步轉化為SA發(fā)揮SAR,同時可能激發(fā)SA相關合成途徑補充大量的SA,使得植株整體保持較高的SA水平。干擾表達CsSAMT-1的轉基因錦橙,僅有兩個株系基因表達水平下調,但四個株系的SA和MeSA含量均較對照植株明顯升高,具體機制有待進一步研究。綜上所述,CsSAMT-1基因參與柑橘響應黃龍病侵染的SA信號轉導途徑,并通過促進SA向MeSA的轉化以增強柑橘對黃龍病的耐性。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S436.66
【圖文】：

第 4 章 結果與分析第 4 章 結果與分析4.1 酸柚和錦橙黃龍病耐性差異分析4.1.1 接種黃龍病后所需發(fā)病時間差異于 2015 年 9 月同時對成熟度一致的錦橙和酸柚各接種黃龍病 20 株，三個月后（2015 年 12 月）提取葉脈 DNA 進行 PCR 檢測植株感病情況。電泳結果顯示，接種的錦橙植株全部檢出 HLB 陽性，而酸柚植株則無一檢出（圖 4.1A、B）。后對酸柚植株每月檢測一次，直到 2016 年 9 月（接種 12 個月），有 10 株酸柚檢出感染了 HLB（圖 4.1 C），且在后續(xù)跟蹤檢測中無新增感病植株。試驗結果表明，接種黃龍病后，酸柚較錦橙所需的發(fā)病時間長。

圖 4.2 酸柚和錦橙感染黃龍病后表型Fig 4.2 The phenotypic of Sour pomelo and Jincheng after infected HLB圖 4.3 顯癥葉片百分比Fig. 4.3 The percentage of symptomatic leaves in single plant注：* 表示酸柚和錦橙之間差異顯著（P ＜0.05）4.1.3 感病后顯癥所需菌量差異為了探究兩種柑橘感染黃龍病后的癥狀與其體內病原菌含量的的關系，對感

【參考文獻】

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1 吳越;蘇華楠;黃愛軍;周彥;李中安;劉金香;周常勇;;柑橘黃龍病菌侵染對甜橙葉片糖代謝的影響[J];中國農業(yè)科學;2015年01期

2 王芳;殷幼平;孫麗琴;吳曉芳;王中康;;柑橘黃龍病罹病植株顯癥差異組織內生細菌群落結構分析[J];微生物學報;2014年08期

3 程春振;曾繼吾;鐘云;閆化學;姜波;鐘廣炎;;柑橘黃龍病研究進展[J];園藝學報;2013年09期

4 駱琰妍;李魏;戴良英;;不同激素信號途徑在植物抗病中的相互作用研究進展[J];中國農學通報;2013年18期

5 歐陽革成;方小端;郭明f ;;以礦物油乳劑為基礎的拒避—誘殺組合防治柑桔木虱試驗初報[J];中國南方果樹;2010年05期

6 孟雪嬌;邸昆;丁國華;;水楊酸在植物體內的生理作用研究進展[J];中國農學通報;2010年15期

7 王文天;彭少麟;李冬梅;王冬梅;王瑞龍;田彩娟;趙厚本;戶桂敏;;薇甘菊水楊酸羧甲基轉移酶基因的分離鑒定及表達分析[J];熱帶亞熱帶植物學報;2009年05期

8 范國成;劉波;吳如健;李韜;蔡子堅;柯沖;;中國柑橘黃龍病研究30年[J];福建農業(yè)學報;2009年02期

9 尹玲莉;侯曉杰;;植物抗性信號分子——水楊酸研究進展[J];中國農學通報;2007年01期

10 劉繼紅,徐小勇,鄧秀新;柑橘體細胞雜種及其核質遺傳研究進展[J];農業(yè)生物技術學報;2004年03期

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1 傅仕敏;柑橘黃龍病的細胞病理及其寄主轉錄組學研究[D];西南大學;2014年

2 黃愛軍;韌皮部桿菌亞洲種簡單重復序列（SSR）多態(tài)性及其侵染甜橙后轉錄組學研究[D];西南大學;2014年

3 馬健;楊樹（Populus spp.）與茶呰子葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）互作中SA和H_2O_2的信號轉導特征[D];中國林業(yè)科學研究院;2012年

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1 秦雙林;基于生物信息學解析t/溪蜜柚和i*柑響應柑橘黃龍病菌侵染的抗性差異[D];江西農業(yè)大學;2016年

2 劉登全;柑橘受黃龍病菌侵染后基因差異表達分析及抗病基因同源序列克隆[D];江西農業(yè)大學;2014年

3 金一鋒;外源性水楊酸誘導月季對黑斑病抗性的研究[D];東北農業(yè)大學;2013年

4 徐日榮;水稻水楊酸甲酯合成酶基因OsBISAMT1的克隆鑒定和功能分析[D];浙江大學;2004年

本文編號：2720715