【摘要】：檢測食品和飼料中的轉(zhuǎn)基因成分和致病菌在原料控制、食品產(chǎn)業(yè)、食品銷售中尤為重要。而傳統(tǒng)的生物基因定性、定量檢測技術(shù)每次只能檢測一種生物基因,而對于成分復(fù)雜的核酸樣品,需要采用多種方法、進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)才能確定,費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高。雖然常規(guī)多重PCR已應(yīng)用于同時(shí)檢測多種生物基因,但在同一反應(yīng)中,經(jīng)常會優(yōu)先擴(kuò)增短片段,并且同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的基因的效果常常很差。而且常規(guī)多重PCR通過電泳進(jìn)行檢測,只能定性,不能定量,通量有限。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對模板進(jìn)行定量分析,但因其有限的檢測通道,檢測通量不高。基因芯片技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對核酸樣品的高通量檢測,但由于定量效果不好,制備過程復(fù)雜,費(fèi)用高昂等缺點(diǎn)并沒有得到廣泛的應(yīng)用。因此,研究一種可以同時(shí)對多種核酸樣品進(jìn)行定性、定量和高通量檢測的方法就顯得非常重要。我們將微滴PCR技術(shù)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來建立了一種基于多重微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法生物基因定性、定量、高通量檢測方法。微滴PCR技術(shù)是將反應(yīng)水相逐滴地加入油相中,形成均一的“油包水”乳化劑,包含109個(gè)油包水的微滴,每個(gè)微滴都可以作為一個(gè)微反應(yīng)器,獨(dú)立地平行地進(jìn)行PCR擴(kuò)增。微滴PCR技術(shù),提高了PCR反應(yīng)的通量,由于每個(gè)微反應(yīng)器中只含有1-2個(gè)模板,因此避免了模板與模板之間的干擾,同時(shí)降低了對寶貴的試劑和樣品的消耗。本方法采用熒光標(biāo)記技術(shù)和熒光酶標(biāo)儀檢測熒光基團(tuán)熒光強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)多重微滴PCR多種擴(kuò)增產(chǎn)物的定性、定量和高通量分析。在不同生物基因的特異性引物的5’端標(biāo)記不同的熒光基團(tuán),經(jīng)過微滴PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化后,每一種微滴PCR產(chǎn)物都會被標(biāo)記上特定的熒光。不同的產(chǎn)物由不同的熒光識別,通過熒光酶標(biāo)儀熒光強(qiáng)度測定可以對實(shí)現(xiàn)不同生物基因的定性、定量分析。在同一個(gè)反應(yīng)管中,每種DNA分子都由特定的的熒光標(biāo)記,因此將微滴PCR與熒光分光光度法結(jié)合起來,可以通過384孔酶標(biāo)板可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測。本研究以轉(zhuǎn)基因玉米(BT176、GA21、NK603和TC1507)為實(shí)驗(yàn)材料對這一理論進(jìn)行了驗(yàn)證。首先分別設(shè)計(jì)它們旁臨序列的特異性引物,選擇合適的熒光基團(tuán)對各對引物的5’端進(jìn)行標(biāo)記,配制相應(yīng)的微滴PCR反應(yīng)液和乳液,反應(yīng)液和乳液在攪拌子的作用下混勻形成微滴,經(jīng)過微滴PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化后,用酶標(biāo)儀檢測產(chǎn)物中相應(yīng)熒光基團(tuán)的熒光強(qiáng)度來同時(shí)對四種轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行定性、定量分析。單重特異性實(shí)驗(yàn)表明,BT176、GA21、NK603和TC1507品系特異性引物和內(nèi)標(biāo)基因特異性引物的特異性均很好,無交叉反應(yīng)。單重靈敏度實(shí)驗(yàn)表明微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法可檢測低至0.5%的轉(zhuǎn)基因玉米,靈敏度高。單重定量檢測四種轉(zhuǎn)基因玉米的檢測限為103拷貝,且線性關(guān)系良好,說明微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法可用于轉(zhuǎn)基因樣品的定量檢測。多重微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法實(shí)驗(yàn)表明,該方法的特異性很好,靈敏度很高,可用于定性和定量分析檢測四種轉(zhuǎn)基因玉米混合物。多重重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明,批內(nèi)各個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米的擴(kuò)增變異系數(shù)都在3%以內(nèi),說明該研究中建立的實(shí)驗(yàn)方法是穩(wěn)定可靠的,批間各個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米的變異系數(shù)都在15%以內(nèi),同樣說明了本研究中建立的實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性很好。模擬樣品檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模擬百分含量的四種轉(zhuǎn)基因玉米經(jīng)過微滴PCR擴(kuò)增后進(jìn)行熒光值測定,得出的GM含量基本與事先預(yù)混的樣品的理論值接近,因此,該實(shí)驗(yàn)方法可實(shí)際應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因玉米的定量和百分含量分析。通過以上實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證得出,利用多重微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法可實(shí)現(xiàn)四種轉(zhuǎn)基因玉米(BT176、GA21、NK603和TC1507)的定性、定量和高通量檢測。以食源性病原菌為實(shí)驗(yàn)材料對微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法這一技術(shù)進(jìn)行重演性分析。重演性分析實(shí)驗(yàn)表明,以轉(zhuǎn)基因玉米為實(shí)驗(yàn)材料建立的基于重微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法可成功應(yīng)用于四種食源性病原菌的定性、定量和高通量分析。重演性結(jié)果可以說明,本研究中建立的多重微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法可以用于所有生物基因的定性、定量和高通量檢測。本研究采用的引物熒光標(biāo)記技術(shù)對靶基因的大小和序列沒有要求,是根據(jù)標(biāo)記的熒光基團(tuán)進(jìn)行識別的,只要引物特異性好,能特異性擴(kuò)增靶基因,微滴PCR產(chǎn)物就能被識別。這對于DNA序列同源性很高,保守區(qū)很短的多種基因同時(shí)檢測優(yōu)勢尤為明顯。采用熒光酶標(biāo)儀對標(biāo)記后的微滴PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測非�？焖�,檢測一種基因只需1秒鐘時(shí)間。Thermo Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀的激發(fā)波長范圍為200-1000 nm,對熒光基團(tuán)的激發(fā)波長和發(fā)射波長進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整,可同時(shí)檢測20種熒光標(biāo)記物,使用384孔酶標(biāo)板,則一次可檢測6000多種基因。微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法提高了目的基因檢測和分析的通量,具有方便、快速、成本低廉、易于推廣、環(huán)境污染少等優(yōu)點(diǎn),可用于所有生物基因的定性、定量和高通量檢測。
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q503
【圖文】：

體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量。特異性 Taqman 熒光定量法是以 Taqman 熒光探針為基礎(chǔ)，Taqman 熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光發(fā)射基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)（圖 1-1）。探針完整時(shí)，發(fā)射基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR 擴(kuò)增時(shí)，Taq 酶的 5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條 DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物的形成完全同步，從而實(shí)現(xiàn)定量。常用的熒光基團(tuán)有 FAM、TET、VIC 和 HEX 等。RT-PC技術(shù)已成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和甜菜等作物轉(zhuǎn)基因成分的檢測，其檢測靈敏度可達(dá) 0.01%以下[46]。鄭秋月等[47]根據(jù)金黃色葡萄菌種屬鑒定 nuc 基因和MRSA 決定因子 mecA 建立了 TaqMan 探針雙色熒光 PCR 方法快速檢測金黃色葡萄球菌, 靈敏度達(dá)到 2.7×103cfu/mL, 且檢測過程只需 1 h 左右，極大縮短了檢測周期。RT-PCR 可以實(shí)現(xiàn)目的基因的定量檢測，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、無需后續(xù)電泳、不開蓋、核酸交叉污染少、易于自動化等優(yōu)點(diǎn)，有效解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，但因儀器設(shè)備的檢測通道有限，檢測通量不高，且需要操作熟練的技術(shù)人員，檢測費(fèi)用昂貴。因此其普及應(yīng)用在一定程度上受到制約。

uno 2003[51]年利用油包水(W/O)的乳液來進(jìn)行 PCR，它的混合物。這些液滴在高溫條件下能保持穩(wěn)定并且充當(dāng)微型 DNA 模板的有效濃度，甚至是低濃度 DNA 模板，目前成。第一步是制備 W/O 乳液。在該步驟中，模板 DNA 滴中進(jìn)行擴(kuò)增。第二步將乳液進(jìn)行破碎。該方法很容易應(yīng)子。Richad Williams 2006 年[52]報(bào)道，通過 PCR 有效擴(kuò)種現(xiàn)象阻礙：首先在同一反應(yīng)管中進(jìn)行多重 PCR 效果很擴(kuò)增，其二，在同源區(qū)會重組產(chǎn)生人工片段。由此，他報(bào)術(shù)將油相和 PCR 反應(yīng)體系的水相進(jìn)行乳化，模板 DNA 微滴中，分開進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增復(fù)雜基因文庫。這種方法使和進(jìn)行高循環(huán)數(shù)成為可能。PCR 混合物的成功乳化能顯比起非乳化的高出大約七分之一的值。所以，微滴 PC擴(kuò)增，減少引物與引物，模板與模板之間的相互干擾，提率。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2720292