【摘要】：檢測食品和飼料中的轉(zhuǎn)基因成分和致病菌在原料控制、食品產(chǎn)業(yè)、食品銷售中尤為重要。而傳統(tǒng)的生物基因定性、定量檢測技術(shù)每次只能檢測一種生物基因,而對于成分復雜的核酸樣品,需要采用多種方法、進行多次實驗才能確定,費時、費力、成本高。雖然常規(guī)多重PCR已應用于同時檢測多種生物基因,但在同一反應中,經(jīng)常會優(yōu)先擴增短片段,并且同時擴增多個目的基因的效果常常很差。而且常規(guī)多重PCR通過電泳進行檢測,只能定性,不能定量,通量有限。實時熒光定量PCR技術(shù)可以通過標準曲線對模板進行定量分析,但因其有限的檢測通道,檢測通量不高。基因芯片技術(shù)可以實現(xiàn)對核酸樣品的高通量檢測,但由于定量效果不好,制備過程復雜,費用高昂等缺點并沒有得到廣泛的應用。因此,研究一種可以同時對多種核酸樣品進行定性、定量和高通量檢測的方法就顯得非常重要。我們將微滴PCR技術(shù)與熒光標記技術(shù)結(jié)合起來建立了一種基于多重微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法生物基因定性、定量、高通量檢測方法。微滴PCR技術(shù)是將反應水相逐滴地加入油相中,形成均一的“油包水”乳化劑,包含109個油包水的微滴,每個微滴都可以作為一個微反應器,獨立地平行地進行PCR擴增。微滴PCR技術(shù),提高了PCR反應的通量,由于每個微反應器中只含有1-2個模板,因此避免了模板與模板之間的干擾,同時降低了對寶貴的試劑和樣品的消耗。本方法采用熒光標記技術(shù)和熒光酶標儀檢測熒光基團熒光強度來實現(xiàn)多重微滴PCR多種擴增產(chǎn)物的定性、定量和高通量分析。在不同生物基因的特異性引物的5’端標記不同的熒光基團,經(jīng)過微滴PCR擴增和產(chǎn)物純化后,每一種微滴PCR產(chǎn)物都會被標記上特定的熒光。不同的產(chǎn)物由不同的熒光識別,通過熒光酶標儀熒光強度測定可以對實現(xiàn)不同生物基因的定性、定量分析。在同一個反應管中,每種DNA分子都由特定的的熒光標記,因此將微滴PCR與熒光分光光度法結(jié)合起來,可以通過384孔酶標板可以實現(xiàn)高通量檢測。本研究以轉(zhuǎn)基因玉米(BT176、GA21、NK603和TC1507)為實驗材料對這一理論進行了驗證。首先分別設(shè)計它們旁臨序列的特異性引物,選擇合適的熒光基團對各對引物的5’端進行標記,配制相應的微滴PCR反應液和乳液,反應液和乳液在攪拌子的作用下混勻形成微滴,經(jīng)過微滴PCR擴增和產(chǎn)物純化后,用酶標儀檢測產(chǎn)物中相應熒光基團的熒光強度來同時對四種轉(zhuǎn)基因玉米進行定性、定量分析。單重特異性實驗表明,BT176、GA21、NK603和TC1507品系特異性引物和內(nèi)標基因特異性引物的特異性均很好,無交叉反應。單重靈敏度實驗表明微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法可檢測低至0.5%的轉(zhuǎn)基因玉米,靈敏度高。單重定量檢測四種轉(zhuǎn)基因玉米的檢測限為103拷貝,且線性關(guān)系良好,說明微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法可用于轉(zhuǎn)基因樣品的定量檢測。多重微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法實驗表明,該方法的特異性很好,靈敏度很高,可用于定性和定量分析檢測四種轉(zhuǎn)基因玉米混合物。多重重復性實驗表明,批內(nèi)各個轉(zhuǎn)基因玉米的擴增變異系數(shù)都在3%以內(nèi),說明該研究中建立的實驗方法是穩(wěn)定可靠的,批間各個轉(zhuǎn)基因玉米的變異系數(shù)都在15%以內(nèi),同樣說明了本研究中建立的實驗方法的重復性很好。模擬樣品檢測實驗結(jié)果表明,模擬百分含量的四種轉(zhuǎn)基因玉米經(jīng)過微滴PCR擴增后進行熒光值測定,得出的GM含量基本與事先預混的樣品的理論值接近,因此,該實驗方法可實際應用于轉(zhuǎn)基因玉米的定量和百分含量分析。通過以上實驗進行驗證得出,利用多重微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法可實現(xiàn)四種轉(zhuǎn)基因玉米(BT176、GA21、NK603和TC1507)的定性、定量和高通量檢測。以食源性病原菌為實驗材料對微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法這一技術(shù)進行重演性分析。重演性分析實驗表明,以轉(zhuǎn)基因玉米為實驗材料建立的基于重微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法可成功應用于四種食源性病原菌的定性、定量和高通量分析。重演性結(jié)果可以說明,本研究中建立的多重微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法可以用于所有生物基因的定性、定量和高通量檢測。本研究采用的引物熒光標記技術(shù)對靶基因的大小和序列沒有要求,是根據(jù)標記的熒光基團進行識別的,只要引物特異性好,能特異性擴增靶基因,微滴PCR產(chǎn)物就能被識別。這對于DNA序列同源性很高,保守區(qū)很短的多種基因同時檢測優(yōu)勢尤為明顯。采用熒光酶標儀對標記后的微滴PCR產(chǎn)物進行檢測非�？焖�,檢測一種基因只需1秒鐘時間。Thermo Varioskan Flash多功能酶標儀的激發(fā)波長范圍為200-1000 nm,對熒光基團的激發(fā)波長和發(fā)射波長進行適當調(diào)整,可同時檢測20種熒光標記物,使用384孔酶標板,則一次可檢測6000多種基因。微滴PCR偶聯(lián)熒光分光光度法提高了目的基因檢測和分析的通量,具有方便、快速、成本低廉、易于推廣、環(huán)境污染少等優(yōu)點,可用于所有生物基因的定性、定量和高通量檢測。
【學位授予單位】：上海師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q503
【圖文】：

體系存在的雙鏈 DNA 數(shù)量。特異性 Taqman 熒光定量法是以 Taqman 熒光探針為基礎(chǔ)，Taqman 熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光發(fā)射基團和一個熒光淬滅基團（圖 1-1）。探針完整時，發(fā)射基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR 擴增時，Taq 酶的 5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團和熒光淬滅基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與 PCR 產(chǎn)物的形成完全同步，從而實現(xiàn)定量。常用的熒光基團有 FAM、TET、VIC 和 HEX 等。RT-PC技術(shù)已成功應用于轉(zhuǎn)基因大豆、玉米和甜菜等作物轉(zhuǎn)基因成分的檢測，其檢測靈敏度可達 0.01%以下[46]。鄭秋月等[47]根據(jù)金黃色葡萄菌種屬鑒定 nuc 基因和MRSA 決定因子 mecA 建立了 TaqMan 探針雙色熒光 PCR 方法快速檢測金黃色葡萄球菌, 靈敏度達到 2.7×103cfu/mL, 且檢測過程只需 1 h 左右，極大縮短了檢測周期。RT-PCR 可以實現(xiàn)目的基因的定量檢測，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、無需后續(xù)電泳、不開蓋、核酸交叉污染少、易于自動化等優(yōu)點，有效解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，但因儀器設(shè)備的檢測通道有限，檢測通量不高，且需要操作熟練的技術(shù)人員，檢測費用昂貴。因此其普及應用在一定程度上受到制約。

uno 2003[51]年利用油包水(W/O)的乳液來進行 PCR，它的混合物。這些液滴在高溫條件下能保持穩(wěn)定并且充當微型 DNA 模板的有效濃度，甚至是低濃度 DNA 模板，目前成。第一步是制備 W/O 乳液。在該步驟中，模板 DNA 滴中進行擴增。第二步將乳液進行破碎。該方法很容易應子。Richad Williams 2006 年[52]報道，通過 PCR 有效擴種現(xiàn)象阻礙：首先在同一反應管中進行多重 PCR 效果很擴增，其二，在同源區(qū)會重組產(chǎn)生人工片段。由此，他報術(shù)將油相和 PCR 反應體系的水相進行乳化，模板 DNA 微滴中，分開進行 PCR 擴增復雜基因文庫。這種方法使和進行高循環(huán)數(shù)成為可能。PCR 混合物的成功乳化能顯比起非乳化的高出大約七分之一的值。所以，微滴 PC擴增，減少引物與引物，模板與模板之間的相互干擾，提率。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王蓓;李淑英;張翠萍;盧國理;周元清;;PCR-DGGE分析玉溪地區(qū)水果泡菜中細菌多樣性[J];云南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學);2017年04期

2 Clive James;;2015年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢[J];中國生物工程雜志;2016年04期

3 鄭秋月;戰(zhàn)曉微;那晗;徐君怡;曹際娟;;食源性MRSA雙色熒光PCR檢測方法建立[J];食品安全質(zhì)量檢測學報;2015年01期

4 陳玲;張菊梅;楊小鵑;吳清平;徐明芳;;南方食品中沙門氏菌污染調(diào)查及分型[J];微生物學報;2013年12期

5 王榮談;姜羽;韋嬌君;張大兵;楊立桃;;轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品的標識與檢測[J];植物生理學報;2013年07期

6 祝儒剛;李拖平;宋立峰;;應用基因芯片技術(shù)檢測肉及肉制品中5種致病菌[J];食品科學;2012年14期

7 陳仁忠;;一起由金黃色葡萄球菌和副溶血性弧菌引起食物中毒的檢測分析[J];海峽預防醫(yī)學雜志;2011年05期

8 薛成玉;遇曉杰;謝平會;董銳;鄭曉華;安宏;閆軍;;食品中沙門氏菌污染狀況分析及VITEK微生物鑒定系統(tǒng)的應用[J];中國初級衛(wèi)生保健;2011年05期

9 吳劍閣;劉英豪;樓萍;李衡華;張延年;;一起由金黃色葡萄球菌腸毒素引起群體性食物中毒的病原學分析[J];現(xiàn)代預防醫(yī)學;2011年08期

10 王雅琴;葉菊蓮;韋俊超;李月華;;一起喪宴引致沙門菌食物中毒的微生物學檢測分析[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2010年10期

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 張廣遠;轉(zhuǎn)基因食品基因芯片檢測及鑒定方法的建立[D];山東師范大學;2013年

本文編號：2720292