【摘要】：粘蟲Mythimna separata(Walker)隸屬于鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuide),是一種重要的世界性農(nóng)業(yè)害蟲。粘蟲之所以在各地頻繁爆發(fā)以致成災(zāi),與其強(qiáng)大的生殖力和特殊的生殖適應(yīng)性密不可分。圍繞生殖調(diào)控決定生殖潛能與適應(yīng)性這一問題,開展生殖相關(guān)基因的研究是必要的。卵黃原蛋白受體(Vitellogenin receptor,VgR)作為介導(dǎo)脂肪體與卵巢間卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵蛋白,對(duì)于卵黃的發(fā)生以及卵母細(xì)胞的發(fā)育和成熟具有重要作用。因此,開展此基因的相關(guān)研究具有重要的理論意義。本文對(duì)粘蟲卵黃蛋白受體VgR基因cDNA全長(zhǎng)序列進(jìn)行了克隆、表達(dá)模式的建立以及功能的鑒定,旨在為粘蟲生殖機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。本文利用反轉(zhuǎn)錄PCR(everse transcription-PCR,RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了粘蟲的VgR基因的全長(zhǎng)cDNA序列,并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)信息分析。然后以β-Tubulin作為內(nèi)參基因,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)技術(shù)建立了該基因在粘蟲不同發(fā)育階段以及不同組織的表達(dá)模式,并通過RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)對(duì)VgR基因進(jìn)行沉默,探究其差異性以進(jìn)一步確定該基因功能。1.粘蟲VgR基因cDNA全長(zhǎng)為5380 bp,開放閱讀框ORF為5328 bp,起始密碼子ATG位于16-18位核苷酸,終止密碼子位于5341-5343位核苷酸,總共編碼1775個(gè)氨基酸,分子量大小為198.995 kDa,等電點(diǎn)為5.11。粘蟲VgR包含154個(gè)磷酸化位點(diǎn),16個(gè)糖基化位。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明,粘蟲VgR蛋白為低密度脂蛋白受體,缺少O-糖鏈結(jié)構(gòu)域(O-linked carbohydratesdomain,OLSD)。粘蟲VgR蛋白包含兩個(gè)配體結(jié)合域(Ligand-binding domain,LBD)和兩個(gè)表皮生長(zhǎng)因子前體同源域(EGF-precursor homology domain,EGFP)。兩個(gè)配體結(jié)合域分別包括4個(gè)和7個(gè)A型重復(fù)序列(LDLa);其中一個(gè)EGFD包括4個(gè)B型重復(fù)基序和7個(gè)YXTD基序集群,而另一個(gè)EGFD由3個(gè)B型重復(fù)基序(LDLb)和2個(gè)YXTD構(gòu)成。該蛋白存在跨膜區(qū)(Transmembrane domain,TMD),屬于跨膜蛋白。VgR的信號(hào)肽位于N端起始位置,由MKYECLILVVLVTWCA EFA這20個(gè)氨基酸構(gòu)成。系統(tǒng)發(fā)育樹中,粘蟲VgR與鱗翅目昆蟲聚在一支,與同為夜蛾科的棉鈴蟲Helicoverpa armigera和斜紋夜蛾Spodoptera litura親緣最近。2.本實(shí)驗(yàn)建立了VgR基因在粘蟲雌蛾和幼蟲不同組織中的表達(dá)模式。在雌蛾各組織中VgR均有表達(dá),卵巢內(nèi)表達(dá)水平顯著高于其它組織,表皮中表達(dá)水平最低。在粘蟲幼蟲不同組織中的表達(dá)模式中,脂肪體內(nèi)VgR基因相較于頭部、表皮、腸道有顯著表達(dá),但表達(dá)量很低。3本實(shí)驗(yàn)建立了VgR基因在雌性粘蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)模式,結(jié)果表明粘蟲VgR基因主要在成蟲期表達(dá),表達(dá)量隨羽化時(shí)間總體呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì),于羽化第二天有明顯表達(dá)上升,升至第五天達(dá)到頂峰,從第六天開始下降。4.本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)對(duì)VgR基因進(jìn)行干擾,結(jié)果顯示處理組(VgR-dsRNA)VgR基因的表達(dá)量于注射后48-60 h明顯低于陰性對(duì)照組(GFP-dsRNA),說明干擾有效地抑制了卵黃原蛋白受體的表達(dá)。同時(shí),分別將此兩組的雌蛹培養(yǎng)至羽化第三天,然后將其卵巢進(jìn)行解剖,對(duì)比發(fā)現(xiàn),處理組的粘蟲卵巢中卵子的卵黃蛋白的沉積明顯受到抑制,發(fā)育較陰性對(duì)照遲緩,與該基因表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果一致。
【學(xué)位授予單位】：山西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S433.4
【圖文】：

山西師范大學(xué)碩士學(xué)位論文2.2.1.5 擴(kuò)增策略及引物設(shè)計(jì)與合成基于粘蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，比對(duì)篩出 VgR 的預(yù)測(cè)序列，然后將該序列分成核心區(qū)域 A、5'末端全長(zhǎng) cDNA 序列 B 以及 3'末端全長(zhǎng) cDNA 序列 C 三部分進(jìn)行分段克隆(圖 2-1)。首先擴(kuò)增中間片段，將其分成五部分段（A1、A2、A3、A4及 A5）設(shè)計(jì)引物逐步擴(kuò)增，每個(gè)片段之間至少 50bp 重疊區(qū)以保證最終序列的完整。根據(jù)測(cè)序得到的核心區(qū)域片段A1和A5分別設(shè)計(jì)特異性引物VgR B1、VgR B2以及 VgR C1、VgR C2。5'端全長(zhǎng) cDNA 序列 B 使用引物 VgR B1、VgR B2 與 5'RACE 的接頭引物 5' outer 和 5' inner 進(jìn)行擴(kuò)增，VgR C1、VgR C2 和 3' RACE 的接頭引物 3' outer 和 3' inner 則用于進(jìn)行 3'端全長(zhǎng) cDNA 序列 C 的擴(kuò)增。將測(cè)序后獲得的片段由 ContingExpress 軟件拼接以獲得粘蟲VgR的全長(zhǎng)cDNA序列，所用引物見表 1 (表 2-3)。

3 結(jié)果隆檢測(cè)說明書步驟提取粘蟲腹部的總 R圖 3-1 所顯示，圖中具有三條清5s，其中 18s 最亮，5s 最暗，18s 完整性較好。利用紫外分光光在 1.8-2.0 之間，雜質(zhì)較少，表明

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 江幸福;張蕾;程云霞;羅禮智;;我國粘蟲研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J];應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào);2014年04期

2 姜玉英;李春廣;曾娟;劉杰;;我國粘蟲發(fā)生概況:60年回顧[J];應(yīng)用昆蟲學(xué)報(bào);2014年04期

本文編號(hào)：2716687