【摘要】：小菜蛾Plutellaxylostella屬于鱗翅目菜蛾科,主要危害青花菜、白菜以及蘿卜等十字花科植物的世界性遷飛害蟲。肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition protein,PGRP)作為一種病原微生物識別蛋白,在小菜蛾抵抗病原菌的過程中有著重要的作用。為了探究肽聚糖識別蛋白的作用機理及其表達調控機制,本課題以小菜蛾作為實驗材料,克隆鑒定出一條肽聚糖識別蛋白PGRP-S2,并闡明PGRP-S2的作用機理及其表達調控機制,主要的研究成果如下:1.根據(jù)小菜蛾的基因組信息,利用RACE技術克隆得到小菜蛾PGRP-S2的開放閱讀框序列,通過生物信息學分析得知該序列編碼的蛋白含有信號肽、PGRP結構域以及酰胺酶結構域等結構,預示著該蛋白可能存在能夠識別和裂解細菌肽聚糖的功能,從而在小菜蛾抵抗病原菌的過程中扮演重要角色。2.利用原核表達系統(tǒng)以及AKTA蛋白純化系統(tǒng)成功獲得目的蛋白PGRP-S2。Western blot分析顯示,PGRP-S2蛋白能夠與大腸桿菌Escherichia coli和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus結合;凝集試驗結果表明,與對照組相比,經過PGRP-S2蛋白處理的E.coli和S.aureus均出現(xiàn)細胞凝集的現(xiàn)象;抑菌試驗結果顯示,PGRP-S2蛋白對E.coli和S.aureus并沒有直接的抑菌活性。綜合上述實驗表明PGRP-S2蛋白具有與細菌結合識別的功能,但并沒有直接殺死細菌的功能,其作用機理可能是通過與肽聚糖的識別從而激活一系列下游信號途徑產生抗菌肽來抵抗病原菌。3.根據(jù)小菜蛾基因組信息,利用普通PCR法克隆得到PGRP-S2基因5'側翼序列 PGRP-S2-P-1937--1。利用 BDGP 分析表明,序列 PGRP-S2-P-1642--1593、PGRP-S2-P-1254--1505、PGRP-S2-P-714--655 以及 PGRP-S2-P-160--111這四個區(qū)域可能是轉錄起始區(qū)域;利用Searchfor CARE分析表明,該側翼序列中包含很多TATA-box以及CAAT-box等真核元件。根據(jù)生物信息學分析結果,對側翼序列PGRP-S2-P-1937--1進行分段克隆并以GFP作為報告基因構建了小菜蛾PGRP-S2基因5'端缺失片段表達載體pET28a-PGRP-S2-P-x-GFP,利用熒光顯微鏡對側翼序列進行啟動子功能鑒定。結果表明側翼序列 PGRP-S2-P-1937--1285、PGRP-S2-P-1467--1078以及 PGRP-S2-P-986--518能夠啟動GFP在大腸桿菌中的表達,具有啟動子功能活性;序列-1937～-1492區(qū)是Acrorrmyrmex echinatior histone-lysine N-methyltransferase SETMAR的基因編碼區(qū),表明PGRP-S2基因5'端-1937～-1285區(qū)不是PGRP-S2基因的啟動子;熒光強度表明序列PGRP-S2-P-986--518啟動子功能活性強于序列PGRP-S2-P-1937--1285,提示PGRP-S2基因的啟動子區(qū)域可能主要位于-986～-518 bp區(qū)域之中。而序列PGRP-S2-P-1937--1、PGRP-S2-P-1467--1、PGRP-S2-P-986--1、PGRP-S2-P-526--1以及PGRP-S2-P-205--1這些區(qū)域的啟動子功能活性都非常弱,表明在-205～-1 bp區(qū)域對PGRP-S2基因啟動子的轉錄調控具有負調控的作用。肽聚糖識別蛋白在小菜蛾抵抗病原微生物的過程中具有重要的作用。利用體外蛋白表達技術以及重組蛋白PGRP-S2與微生物病原菌-大腸桿菌和金黃色葡萄球菌之間互作關系的分析,深入研究肽聚糖識別蛋白PGRP-S2的作用機理;同時結合其5'端側翼序列缺失片段功能鑒定來研究肽聚糖識別蛋白PGRP-S2的表達調控機制。從小菜蛾抵御病原微生物的免疫系統(tǒng)著手,揭示小菜蛾對細菌侵染的免疫機理,為新型細菌殺蟲劑的開發(fā)提供了理論基礎。
【學位授予單位】：福建師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S433.4
【圖文】：

蛋白質為水溶性蛋白質。逡逑用Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ對ＰＧＲＰ－Ｓ２氨基酸序列的親疏水性進行分析，正值表示疏水性，正逡逑值越高表明疏水性越強；負值表示親水性，負值越低表明親水性越強。從圖１－５可逡逑以看出，該蛋白質的多肽鏈在第１１３位的氨基酸具有最低值為－２．１７８，親水性最強；逡逑多肽鏈在第７位跟第１１位的氨基酸具有最高值為２．７２２，疏水性最強。從整體來看，逡逑整條肽鏈的大多數(shù)氨基酸為親水性的氨基酸且多于疏水性的氨基酸，表明ＰＧＲＰ－Ｓ２逡逑所編碼的蛋白質為親水性蛋白質，該結果跟Ｐｒｏｔｐａｒａｍ分析的結果一致。逡逑￣＇邐Ｈｐｈｏｂ．邋／邋Ｋｙｔｅ邋Ｓ＜邋Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ邋－逡逑２－５邋－ｆＡ逡逑２邋￣邋Ｉ邋Ｉ邐邐－逡逑＂１：邋％邋＇（）邋ｙ邋，邋Ｉ邋Ｌ邐■逡逑：：：＿＿＿＿霉逡逑－２邋－邐Ｉ逡逑＿２邋５邐■邐ｉ邐ｉ邐１邐１邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑２０邐４０邐６０邐８０邐１００邐１２０邐１４０邐１６０邐１８０逡逑Ｐｏｓｉｔｉｏｎ逡逑圖１－５邋ＰＧＲＰ－Ｓ２的親疏水性分析逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－５邋Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ邋ＰＧＲＰ－Ｓ２逡逑２１逡逑

福建師范大學吳程碩士學位論文３．３．２信號肽與跨膜結構分析逡逑用ＳｉｇｎａｌＰ４．１分析該蛋白是否存在信號肽（圖１－６），結果表明該蛋白存在一信號肽，其位置由起始位點開始至第２１個氨基酸結束。用ＴＭＨＭＭ預測該蛋白否存在跨膜結構（圖１－７），結果表明該蛋白沒有典型的跨膜曲線，其并未從細跨越至細胞外，指示該蛋白不存在跨膜結構。結合該蛋白含有信號肽，預測該為分泌蛋白，其發(fā)揮作用的機理是當受到外界的感染時，該蛋白由其信號肽指而分泌至細胞外與侵染物結合而發(fā)揮其作用。逡逑￣’０■邋ｓｃｏｒｅ邐＿邋邐：＂＂逡逑？邐逡逑

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本文編號：2713194