【摘要】：小菜蛾P(guān)lutellaxylostella屬于鱗翅目菜蛾科,主要危害青花菜、白菜以及蘿卜等十字花科植物的世界性遷飛害蟲。肽聚糖識別蛋白(peptidoglycan recognition protein,PGRP)作為一種病原微生物識別蛋白,在小菜蛾抵抗病原菌的過程中有著重要的作用。為了探究肽聚糖識別蛋白的作用機(jī)理及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制,本課題以小菜蛾作為實(shí)驗(yàn)材料,克隆鑒定出一條肽聚糖識別蛋白PGRP-S2,并闡明PGRP-S2的作用機(jī)理及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制,主要的研究成果如下:1.根據(jù)小菜蛾的基因組信息,利用RACE技術(shù)克隆得到小菜蛾P(guān)GRP-S2的開放閱讀框序列,通過生物信息學(xué)分析得知該序列編碼的蛋白含有信號肽、PGRP結(jié)構(gòu)域以及酰胺酶結(jié)構(gòu)域等結(jié)構(gòu),預(yù)示著該蛋白可能存在能夠識別和裂解細(xì)菌肽聚糖的功能,從而在小菜蛾抵抗病原菌的過程中扮演重要角色。2.利用原核表達(dá)系統(tǒng)以及AKTA蛋白純化系統(tǒng)成功獲得目的蛋白PGRP-S2。Western blot分析顯示,PGRP-S2蛋白能夠與大腸桿菌Escherichia coli和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus結(jié)合;凝集試驗(yàn)結(jié)果表明,與對照組相比,經(jīng)過PGRP-S2蛋白處理的E.coli和S.aureus均出現(xiàn)細(xì)胞凝集的現(xiàn)象;抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示,PGRP-S2蛋白對E.coli和S.aureus并沒有直接的抑菌活性。綜合上述實(shí)驗(yàn)表明PGRP-S2蛋白具有與細(xì)菌結(jié)合識別的功能,但并沒有直接殺死細(xì)菌的功能,其作用機(jī)理可能是通過與肽聚糖的識別從而激活一系列下游信號途徑產(chǎn)生抗菌肽來抵抗病原菌。3.根據(jù)小菜蛾基因組信息,利用普通PCR法克隆得到PGRP-S2基因5'側(cè)翼序列 PGRP-S2-P-1937--1。利用 BDGP 分析表明,序列 PGRP-S2-P-1642--1593、PGRP-S2-P-1254--1505、PGRP-S2-P-714--655 以及 PGRP-S2-P-160--111這四個(gè)區(qū)域可能是轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域;利用Searchfor CARE分析表明,該側(cè)翼序列中包含很多TATA-box以及CAAT-box等真核元件。根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果,對側(cè)翼序列PGRP-S2-P-1937--1進(jìn)行分段克隆并以GFP作為報(bào)告基因構(gòu)建了小菜蛾P(guān)GRP-S2基因5'端缺失片段表達(dá)載體pET28a-PGRP-S2-P-x-GFP,利用熒光顯微鏡對側(cè)翼序列進(jìn)行啟動(dòng)子功能鑒定。結(jié)果表明側(cè)翼序列 PGRP-S2-P-1937--1285、PGRP-S2-P-1467--1078以及 PGRP-S2-P-986--518能夠啟動(dòng)GFP在大腸桿菌中的表達(dá),具有啟動(dòng)子功能活性;序列-1937～-1492區(qū)是Acrorrmyrmex echinatior histone-lysine N-methyltransferase SETMAR的基因編碼區(qū),表明PGRP-S2基因5'端-1937～-1285區(qū)不是PGRP-S2基因的啟動(dòng)子;熒光強(qiáng)度表明序列PGRP-S2-P-986--518啟動(dòng)子功能活性強(qiáng)于序列PGRP-S2-P-1937--1285,提示PGRP-S2基因的啟動(dòng)子區(qū)域可能主要位于-986～-518 bp區(qū)域之中。而序列PGRP-S2-P-1937--1、PGRP-S2-P-1467--1、PGRP-S2-P-986--1、PGRP-S2-P-526--1以及PGRP-S2-P-205--1這些區(qū)域的啟動(dòng)子功能活性都非常弱,表明在-205～-1 bp區(qū)域?qū)GRP-S2基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有負(fù)調(diào)控的作用。肽聚糖識別蛋白在小菜蛾抵抗病原微生物的過程中具有重要的作用。利用體外蛋白表達(dá)技術(shù)以及重組蛋白PGRP-S2與微生物病原菌-大腸桿菌和金黃色葡萄球菌之間互作關(guān)系的分析,深入研究肽聚糖識別蛋白PGRP-S2的作用機(jī)理;同時(shí)結(jié)合其5'端側(cè)翼序列缺失片段功能鑒定來研究肽聚糖識別蛋白PGRP-S2的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。從小菜蛾抵御病原微生物的免疫系統(tǒng)著手,揭示小菜蛾對細(xì)菌侵染的免疫機(jī)理,為新型細(xì)菌殺蟲劑的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：福建師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S433.4
【圖文】：

蛋白質(zhì)為水溶性蛋白質(zhì)。逡逑用Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ對ＰＧＲＰ－Ｓ２氨基酸序列的親疏水性進(jìn)行分析，正值表示疏水性，正逡逑值越高表明疏水性越強(qiáng)；負(fù)值表示親水性，負(fù)值越低表明親水性越強(qiáng)。從圖１－５可逡逑以看出，該蛋白質(zhì)的多肽鏈在第１１３位的氨基酸具有最低值為－２．１７８，親水性最強(qiáng)；逡逑多肽鏈在第７位跟第１１位的氨基酸具有最高值為２．７２２，疏水性最強(qiáng)。從整體來看，逡逑整條肽鏈的大多數(shù)氨基酸為親水性的氨基酸且多于疏水性的氨基酸，表明ＰＧＲＰ－Ｓ２逡逑所編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)，該結(jié)果跟Ｐｒｏｔｐａｒａｍ分析的結(jié)果一致。逡逑￣＇邐Ｈｐｈｏｂ．邋／邋Ｋｙｔｅ邋Ｓ＜邋Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ邋－逡逑２－５邋－ｆＡ逡逑２邋￣邋Ｉ邋Ｉ邐邐－逡逑＂１：邋％邋＇（）邋ｙ邋，邋Ｉ邋Ｌ邐■逡逑：：：＿＿＿＿霉逡逑－２邋－邐Ｉ逡逑＿２邋５邐■邐ｉ邐ｉ邐１邐１邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑２０邐４０邐６０邐８０邐１００邐１２０邐１４０邐１６０邐１８０逡逑Ｐｏｓｉｔｉｏｎ逡逑圖１－５邋ＰＧＲＰ－Ｓ２的親疏水性分析逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－５邋Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ邋ＰＧＲＰ－Ｓ２逡逑２１逡逑

福建師范大學(xué)吳程碩士學(xué)位論文３．３．２信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)分析逡逑用ＳｉｇｎａｌＰ４．１分析該蛋白是否存在信號肽（圖１－６），結(jié)果表明該蛋白存在一信號肽，其位置由起始位點(diǎn)開始至第２１個(gè)氨基酸結(jié)束。用ＴＭＨＭＭ預(yù)測該蛋白否存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖１－７），結(jié)果表明該蛋白沒有典型的跨膜曲線，其并未從細(xì)跨越至細(xì)胞外，指示該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。結(jié)合該蛋白含有信號肽，預(yù)測該為分泌蛋白，其發(fā)揮作用的機(jī)理是當(dāng)受到外界的感染時(shí)，該蛋白由其信號肽指而分泌至細(xì)胞外與侵染物結(jié)合而發(fā)揮其作用。逡逑￣’０■邋ｓｃｏｒｅ邐＿邋邐：＂＂逡逑？邐逡逑

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本文編號：2713194