【摘要】：灰蓋鬼傘是研究子實(shí)體發(fā)育的常用的模式真菌,目前灰蓋鬼傘全基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成,但依然有很多預(yù)測(cè)基因功能是未知的。然而因?yàn)橥粗亟M的效率極低,通過(guò)同源重組進(jìn)行基因敲除來(lái)研究基因功能的方法在灰蓋鬼傘中極為困難。CRISPR-Cas9是由一段非編碼的RNA引導(dǎo)Cas9蛋白在識(shí)別序列附近切割基因組,產(chǎn)生DNA雙鏈切口(DSBs),DSBs激發(fā)細(xì)胞的同源重組或非同源末端連接機(jī)制修復(fù)DNA斷裂,從而實(shí)現(xiàn)外源基因的靶向插入或內(nèi)源基因的定向敲除。本文以灰蓋鬼傘為研究對(duì)象,嘗試在灰蓋鬼傘中建立CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng),來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)鬼傘中更多基因功能的研究。在真菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中,用酶酶解真菌細(xì)胞細(xì)胞壁使其形成原生質(zhì)體,是準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞最常用的方法。比如在灰蓋鬼傘轉(zhuǎn)化體系中,使用纖維素酶和幾丁質(zhì)酶處理孢子形成原生質(zhì)體[1]。本實(shí)驗(yàn)使用在畢赤酵母中異源表達(dá)純化的、對(duì)灰蓋鬼傘自溶時(shí)有重要作用的幾丁質(zhì)酶ChiⅢ和ChiEn1,代替商品化幾丁質(zhì)酶酶解細(xì)胞壁,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明異源表達(dá)的幾丁質(zhì)酶ChiⅢ在等酶活情況下,能夠代替商品化的幾丁質(zhì)酶制備原生質(zhì)體,ChiEn1對(duì)ChiⅢ的酶解具有協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)室目前灰蓋鬼傘轉(zhuǎn)化的篩選僅依賴于營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株AmutBmut,由于缺少高效的選擇標(biāo)記,還不能對(duì)灰蓋鬼傘進(jìn)行雙基因或多基因同時(shí)敲除。為了更好的利用CRISPR-Cas9基因編輯工具,本實(shí)驗(yàn)在灰蓋鬼傘中建立了萎銹靈抗性篩選標(biāo)記,該篩選標(biāo)記作用濃度低,成本低,并且抗性基因來(lái)自于灰蓋鬼傘內(nèi)源基因,在灰蓋鬼傘中表達(dá)效率很高。本實(shí)驗(yàn)嘗試在灰蓋鬼傘中建立CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng),首先我們將表達(dá)Cas9蛋白的質(zhì)粒和sgRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到灰蓋鬼傘中實(shí)現(xiàn)基因編輯,但是該方法以能夠在鬼傘中找到表達(dá)sgRNA的U6(或U3)啟動(dòng)子和成功表達(dá)Cas9蛋白的為前提,然而,在鬼傘中表達(dá)sgRNA的U6(或者U3)啟動(dòng)子尚未明確,并且實(shí)驗(yàn)證明我們獲得的Cas9基因在灰蓋鬼傘中不表達(dá)。因此我們選擇使用RNA引導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶(RGENs)來(lái)介導(dǎo)灰蓋鬼傘的基因編輯。我們將體外表達(dá)純化的Cas9蛋白和體外轉(zhuǎn)錄形成的sgRNA結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合物(RNPs),再轉(zhuǎn)化到灰蓋鬼傘中來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組基因編輯的目的,但是該方法在體外剪切和體內(nèi)轉(zhuǎn)化中都沒(méi)有實(shí)現(xiàn)剪切,這可能與Cas9蛋白體外純化后容易降解、sgRNA轉(zhuǎn)錄后極易降解、設(shè)計(jì)的sgRNA引導(dǎo)剪切活性低等原因有關(guān)。我們可以通過(guò)多設(shè)計(jì)幾條sgRNA、改善實(shí)驗(yàn)無(wú)RNA酶環(huán)境、或者優(yōu)化Cas9蛋白序列等方法來(lái)改進(jìn)灰蓋鬼傘中CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的研究。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q78
【圖文】：

圖１．２邋ｔｒａｃｒＲＮＡ：邋ｃｒＲＮＡ與靶基因序列和Ｃａｓ９蛋白的結(jié)合逡逑Ｆｉｇ邋１．２邋ｔｒａｃｒＲＮＡ：邋ｃｒＲＮＡ邋ｂｉｎｄ邋ｔｏ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｎｄ邋Ｃａｓ９邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑前，在人類細(xì)胞［５Ｇ］、小鼠［５１］、斑馬魚(yú)［５２］、新桿狀線蟲(chóng)［５３］、果蠅［５４］

邐３邐４逡逑圖２．２原生質(zhì)體的制備率。１為商品化纖維素／幾丁質(zhì)混合酶解液組；２為商品化纖維素酶逡逑和與商品化幾丁質(zhì)酶等酶活的Ｃｈｉｌｌｉ混合酶解液組；３為商品化纖維素酶和與商品化幾丁逡逑１５逡逑

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本文編號(hào)：2713165