【摘要】：目的:檢測(cè)TBX4(T-box transcription factor 4)基因在正常和肛門直腸畸形大鼠肛門直腸發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空表達(dá),探討其可能與肛門直腸發(fā)育的關(guān)系。方法:將Wistar大鼠按雌雄比例5:1晚上合籠過(guò)夜,次日晨雌鼠做陰道涂片。在光鏡下見到精子即提示交配,當(dāng)日為孕0天(E0),將孕鼠隨機(jī)分為兩組。ETU組孕鼠于E10時(shí)按12.5m L/kg給予1%ETU溶液經(jīng)灌胃針注入大鼠胃內(nèi);對(duì)照組孕鼠于E10時(shí)按12.5m L/kg給予生理鹽水灌胃。對(duì)兩組大鼠做以下處理:在胚胎發(fā)育第13天(E13)至16天(E16)時(shí)取材,在10%水合氯醛(4m L/kg)腹腔注射麻醉下,行剖宮術(shù),取出胎鼠,所有標(biāo)本經(jīng)0.01MPBS液沖洗。將一部分胚胎置于4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定72小時(shí),常規(guī)脫水,石蠟包埋,制成蠟塊,對(duì)照組及ETU組的胎鼠正中矢狀面連續(xù)切片,切片厚度4μm,根據(jù)鏡下觀察進(jìn)一步分為正常組和ARM組,進(jìn)行TBX4免疫組織化學(xué)染色。其余對(duì)照組和ETU組的胎鼠,在顯微鏡下辨別畸形后進(jìn)一步分為正常組和ARM組,用Western Blot方法檢測(cè)正常與ARM組胎鼠直腸組織TBX4蛋白的表達(dá),RT-PCR方法檢測(cè)正常組與ARM組TBX4 m RNA的表達(dá)。結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示:正常組:E13時(shí),TBX4陽(yáng)性細(xì)胞分布于后腸上皮、泌尿生殖竇上皮,特異性陽(yáng)性染色強(qiáng)度較弱,泄殖腔膜內(nèi)僅見極少量陽(yáng)性細(xì)胞;E14時(shí),泄殖腔管、后腸上皮內(nèi)可以觀察到較多TBX4陽(yáng)性細(xì)胞,未來(lái)肛門開口區(qū)域的泄殖腔膜可見大量的陽(yáng)性細(xì)胞,同時(shí),在泌尿生殖竇背側(cè)上皮也可見較多陽(yáng)性細(xì)胞;E15時(shí),直腸、肛膜可見大量的TBX4陽(yáng)性細(xì)胞,尿道上皮上也出現(xiàn)一定量的陽(yáng)性細(xì)胞;E16時(shí),直腸末端上皮和尿道下端背側(cè)上皮也可見TBX4陽(yáng)性細(xì)胞,但數(shù)量較E15明顯減少。ARM組:E13時(shí),后腸上皮、泄殖腔膜內(nèi)均未見陽(yáng)性細(xì)胞;E14時(shí),泄殖腔管內(nèi)可以觀察到散在分布的陽(yáng)性細(xì)胞,后腸內(nèi)僅有接近泄殖腔管處有少量的陽(yáng)性細(xì)胞,背側(cè)泄殖腔膜外層僅有極少量陽(yáng)性細(xì)胞;E15時(shí),直腸尿道之間可見瘺管,TBX4在后腸上皮、瘺管、尿道上皮、背側(cè)泄殖腔膜內(nèi)表達(dá)極弱,特異性陽(yáng)性染色不明顯;E16時(shí),瘺管上皮中可見散在的陽(yáng)性細(xì)胞,直腸末端上皮、尿道下端背側(cè)上皮內(nèi)僅有零星的陽(yáng)性細(xì)胞。Western Blot結(jié)果顯示:E13-E16,TBX4蛋白在正常組和ARM組都有表達(dá)。E14-E16,ARM組TBX4表達(dá)明顯減少,尤其在E15時(shí),ARM組TBX4蛋白表達(dá)量明顯少于正常組(TBX4蛋白:1.25±0.67 vs 2.13±1.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。RT-PCR結(jié)果顯示:E13-E16,在正常組和ARM組大鼠胚胎中均能檢測(cè)出TBX4 m RNA。在正常組,E13-E16 TBX4 m RNA表達(dá)量逐漸增高。在E13、E15時(shí),ARM組TBX4 m RNA的表達(dá)量明顯少于正常組(E13 TBX4 m RNA:0.48±0.18 vs 1.20±0.62,P0.05;E15 TBX4 m RNA:0.96±0.35vs 1.61±0.44,P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:TBX4基因在肛門直腸畸形大鼠肛門直腸發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期表達(dá)下調(diào)可能與肛門直腸畸形的發(fā)生有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R725.7
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 大體觀察結(jié)果正常對(duì)照組胎鼠未見畸形發(fā)生。用乙烯硫脲(ethylenethiourea，ETU)致畸，致畸率約為 80%，畸形胎鼠均為無(wú)尾或短尾，畸形類型為直腸尿道瘺和一穴肛，作為ARM 組。3.2 免疫組化結(jié)果正常組：E13 時(shí)，TBX4 陽(yáng)性細(xì)胞分布于后腸上皮、泌尿生殖竇上皮，特異性陽(yáng)性染色強(qiáng)度較弱，泄殖腔膜內(nèi)僅見極少量陽(yáng)性細(xì)胞（圖 1a、 2b）。ARM 組：E13 時(shí)，后腸上皮、泄殖腔膜內(nèi)均未見陽(yáng)性細(xì)胞（圖 1c、 1d）。

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文正常組：E14 時(shí)，泄殖腔管、后腸上皮內(nèi)可以觀察到較多 TBX4 陽(yáng)性細(xì)胞，未來(lái)肛門開口區(qū)域的泄殖腔膜可見大量的陽(yáng)性細(xì)胞，同時(shí)，在泌尿生殖竇背側(cè)上皮也可見較多的陽(yáng)性細(xì)胞（圖 2a、2b）。ARM 組：E14 時(shí)，泄殖腔管內(nèi)可以觀察到散在分布的陽(yáng)性細(xì)胞，后腸內(nèi)僅有接近泄殖腔管處有少量的陽(yáng)性細(xì)胞，背側(cè)泄殖腔膜外層僅有少量陽(yáng)性細(xì)胞（圖 2c、2d）。

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