【摘要】：馬尾松(Pinus massoniana Lamb)屬于松科松屬植物,是中國(guó)重要的造林與用材樹(shù)種之一,單性花,雌雄同株。通常馬尾松大孢子葉球2-5個(gè)為一簇著生于新枝頂端,偶有小孢子葉球發(fā)生性反轉(zhuǎn)而形成的幾十甚至上百個(gè)簇生在一起的“多球果”現(xiàn)象”。該性狀具有很高的遺傳穩(wěn)定性,在提高種子產(chǎn)量上有很高的潛在應(yīng)用價(jià)值。本研究利用新一代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)馬尾松小孢子葉球性反轉(zhuǎn)前后及正常孢子葉球?qū)φ者M(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,挖掘馬尾松多球果形成過(guò)程中的相關(guān)基因,豐富了馬尾松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。同時(shí)利用RACE和RT-PCR技術(shù),對(duì)馬尾松開(kāi)花相關(guān)基因進(jìn)行克隆和表達(dá)分析,為多球果現(xiàn)象的生殖調(diào)控機(jī)理研究提供參考。其主要研究結(jié)果如下:(1)采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)馬尾松小孢子葉球性反轉(zhuǎn)前后及正常孢子葉球?qū)φ者M(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,共獲得190023條unigene,平均長(zhǎng)度為595bp。已注釋的unigene分為56個(gè)功能組和130個(gè)代謝途徑,共涉及到核糖體、碳代謝、氨基酸的生物合成等生理生化過(guò)程。多球果枝上的大、小孢子葉球之間差異基因4758條,正常球果枝上的大、小孢子葉球之間差異基因5550條,多球果枝上的小孢子葉球性反轉(zhuǎn)為雙性孢子葉球的差異基因1188條。小孢子葉球性反轉(zhuǎn)為雙性孢子葉球的過(guò)程中(PM-wvsPM-b)所特有的差異基因有69條,這些基因可能與引發(fā)性反轉(zhuǎn)過(guò)程的因子相關(guān)。轉(zhuǎn)錄本對(duì)比發(fā)現(xiàn),赤霉素途徑和光周期途徑中的基因在發(fā)生性反轉(zhuǎn)的雙性孢子葉球中存在表達(dá)差異,這些差異基因可能參與多球果的發(fā)育過(guò)程。(2)利用RACE技術(shù)從馬尾松中克隆得到CONSTANS同源基因,命名為PmCO1,全長(zhǎng)為1448bp,其開(kāi)放閱讀框?yàn)?329bp,編碼442個(gè)氨基酸。表達(dá)分析顯示,PmCO1在馬尾松不同狀態(tài)的孢子葉球以及不同組織中均有表達(dá),即在多球果整個(gè)發(fā)育狀態(tài)中,其表達(dá)量先增加后降低,說(shuō)明PmCO1基因在馬尾松孢子葉球的性別分化過(guò)程中起一定的作用。(3)基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),采用普通PCR技術(shù),克隆得到PmCO2和PmGID1基因,全長(zhǎng)分別為1461bp、1189bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?164bp、1062bp,分別編碼387個(gè)、353個(gè)氨基酸。表達(dá)分析顯示,PmCO2在多球果和正常球果的不同發(fā)育狀態(tài)中均有表達(dá)且存在差異,說(shuō)明該基因參與調(diào)控多球果與正常球果由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的過(guò)程。PmCO2雖然在多球果與正常球果中均有表達(dá),但與PmCO1基因的時(shí)空表達(dá)模式并不相同,說(shuō)明PmCO1與PmCO2基因在多球果與正常球果由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的過(guò)程中調(diào)控機(jī)制不同。同時(shí)PmCO2的成功克隆,說(shuō)明在馬尾松中存在多個(gè)CO同源基因;PmGID1表達(dá)分析顯示,從尚未發(fā)生性反轉(zhuǎn)的小孢子葉球→性反轉(zhuǎn)中的雙性孢子葉球→性反轉(zhuǎn)形成的大孢子葉球這一發(fā)育過(guò)渡狀態(tài)中,PmGID1的表達(dá)量逐漸增加,推測(cè)PmGID1可能參與調(diào)控馬尾松多球果的形成。不同組織中莖部表達(dá)量最高,葉最低,兩者相差13.73倍,存在顯著性差異。
【圖文】：

程中的誘導(dǎo)因子提供了有用的數(shù)據(jù)資源。2.1 材料材料取自中國(guó)貴州省都勻市馬鞍山馬尾松國(guó)有良種基地基因收集區(qū)（北緯 26°16'、東經(jīng)107°31'），采集時(shí)間為 2016 年 4 月 6 日，，選擇一株發(fā)生性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象的十八年生的馬尾松。該樹(shù)上具有多球果枝和正常枝兩種類(lèi)型，正常枝上大、小孢子葉球發(fā)育正常不發(fā)生性反轉(zhuǎn)，多球果枝上具有小孢子葉球發(fā)生性反轉(zhuǎn)為大孢子葉球的現(xiàn)象，產(chǎn)生多球果（圖 2-1）。經(jīng)項(xiàng)目組前期觀(guān)測(cè)，多球果性反轉(zhuǎn)過(guò)程主要是在已形成的小孢子葉球的基礎(chǔ)上進(jìn)行，通過(guò)解剖學(xué)性發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)中的雙性孢子葉球表現(xiàn)出雌雄兩性特征。采集多球果枝上的還未發(fā)生性反轉(zhuǎn)的小孢子葉球（PM_w）、性反轉(zhuǎn)中的雙性孢子葉球（PM_b）、性反轉(zhuǎn)形成的大孢子葉球（PM_q）和正常枝上的大孢子葉球（PM_f）、小孢子葉球（PM_m），共五個(gè)樣本，三次重復(fù)，樣品放入液氮保存?zhèn)溆�。材料采集�?lèi)型說(shuō)明和圖片詳見(jiàn)下表 2-1 和圖 2-2。

貴州大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位論文表 2-1 實(shí)驗(yàn)材料類(lèi)型說(shuō)明Tab.2-1 Description of the type of experimental materials樣本 樣品說(shuō)明 采集部位 材料來(lái)源PM_b 性反轉(zhuǎn)中的雙性孢子葉球 多球果枝 同一棵多球果樹(shù)PM_q 小孢子葉球經(jīng)過(guò)性反轉(zhuǎn)形成的大孢子葉球 多球果枝 同一棵多球果樹(shù)PM_w 小孢子葉球 多球果枝 同一棵多球果樹(shù)PM_f 大孢子葉球 正常枝 同一棵多球果樹(shù)PM_m 小孢子葉球 正常枝 同一棵多球果樹(shù)
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S791.248

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2710482