【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源、長度為22nt左右,在多種真核生物中調(diào)控基因表達的非編碼小RNA。在植物中,它參與了許多生物過程,包括植物的生長、發(fā)育及生物與非生物脅迫(包括病害,寒冷,高鹽,干旱等)響應。小麥是人們主要的糧食作物之一,在世界各地均能生產(chǎn)。寒脅迫對小麥等經(jīng)濟作物的生長發(fā)育及產(chǎn)量有極負面的影響。東北農(nóng)業(yè)大學自主培育出了能克服黑龍江地區(qū)高寒氣候條件的強耐寒品種“東農(nóng)冬麥1號”(Dn1)(返青率高達85%),有著重要抗寒相關miRNA資源。從miRNA方向研究其寒脅迫下的糖代謝應答機制,對于豐富小麥抗寒理論、培育抗寒品種具有重要的理論和實踐意義。本研究以大田自然降溫條件下種植Dn1為基礎材料,探討低溫對小麥糖代謝相關miRNA即tae-miR5049-3p、tae-miR1120a,及其靶基因6PGL和FBA表達模式的影響。使用花序侵染法,將pre-tae-miR5049-3p轉化到野生型擬南芥(哥倫比亞型)中。驗證擬南芥中tae-miR5049-3p及其靶基因的表達模式,并檢測擬南芥的生理指標。得到以下主要結果:(1)在自然降溫的四個溫度區(qū)(5℃,0℃,-10℃,-25℃)下,Dn1的tae-miR5049-3p和tae-miRNA1120a表達模式為:分蘗節(jié):隨著溫度降低,miR5049-3p的表達量呈先升高后降低的變化規(guī)律,而miR1120a的表達量則呈“升-降-升”的變化規(guī)律,二者均在0℃時相對表達量最高;葉片中:隨著溫度降低,miR5049-3p呈“先升后降”的趨勢,-10℃表達量最高,5℃時相對表達最低;miR1120a則隨著溫度的降低表達量逐漸升高(-25℃達到最高)。靶基因:6PGL和FBA分別與其對應的tae-miR5049-3p和tae-miRNA1120a呈負調(diào)控表達關系。(2)生物信息學分析結果初步揭示了6PGL和FBA基因編碼的蛋白的結構,得知1)6PGL和FBA所編碼的蛋白分別具有其典型結構域;其中6PGL的氨基酸序列中含有SugarP_isomerase superfamily結構域,該結構域是典型的磷酸糖異構酶家族結構域,而磷酸糖異構酶家族就包含6PGL。而FBA蛋白質(zhì)則具有典型的ICL_KPHMT superfamily結構域是果糖二磷酸醛縮酶域結構。2)6PGL和FBA蛋白可能分別定位于葉綠體和細胞質(zhì)且為非分泌型蛋白。3)6PGL蛋白主要以多種空間結構組合而成;而FBA蛋白的3D結構主要以螺旋為主。(3)利用花序侵染法成功轉染擬南芥,獲得ox-pre-miR5049-3p轉基因陽性植株(T3代)。對其進行4℃低溫脅迫24 h處理后,檢測miR5049-3p及其靶基因6PGL的表達,顯示兩者負向調(diào)控;同時,檢測其轉基因植株的生理指標(葉綠素含量,傷害率,MDA含量),表明ox-pre-miR5049-3p轉基因植株的抗寒性高于野生型。通過RT-PCR及過表達植株驗證,本研究證實了低溫脅迫下,tae-miR5049-3p能通過降低自身表達量負向調(diào)控6PGL的表達量升高,從而介導糖代謝途徑提高植株抗寒性。本研究初步揭示了miRNA調(diào)控Dn1糖代謝響應冷脅迫的機制,對于強抗寒冬小麥新品種的分子育種,具有重要的理論意義和應用前景。
【圖文】：

與分析控糖代謝的抗寒相關 miRNAs 及其靶基因的表達模 的總 RNA 提取及反轉錄 所示，用 1%瓊脂糖凝膠檢測的提取 5℃、0℃、-10℃、-25℃下 Dn1 分蘗節(jié)。使用超微紫外分光光度計檢測 RNA 質(zhì)量，數(shù)據(jù)顯示每個樣品總 RNA 提圍內(nèi)，可以用于接下來的 cDNA 模板合成。通過 miRNA 通用的反轉錄引 Dn1 樣品總 RNA 進行反轉錄，，分別得到每個樣品的 miRNA cDNA 第一

iR5049-3p（A1），miR1120a（A2）成熟體、6PGL（B1）及 FBA（B2）的增產(chǎn)物3-2 PCR products of miR5049-3p ( A1 )、 miR1120a ( A2 )、6PGL（B1）an（B2）表 3-1 擴增 miRNA 及其靶基因的引物序列Table 3-1 Reaction sequence of primers used in qRT-PCR引物名稱 引物序列5049-3pF1120aF6PGLF6PGLRFBAFFBARactinFactinR5’-AATATGGATCGGAGGGAGTAC-3’5’-ACATTCTTATATTATGAGACGGAG-3’5’- CTGGAGACGGTTGACTGGAG -3’5’-GGCATCATTGATAGCATACACTTG-3’5’-AAGACGGAGAATGAGGAGAAGG-3’5’-ACGGAGGTAGTAAGCAGGAATG-3’5’-CCTTAGTACCTTCCAACAGATGT-3’5’-CCAGACAACTCGCAACTTAGA-3’結果經(jīng)數(shù)據(jù)分析后，得到低溫脅迫下 Dn1 分蘗節(jié)和葉片中的 miRNAs 及變化情況。結果表明， miR5049-3p 和 miR1120a 在分蘗節(jié)和葉片中均有表
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S512.11

【參考文獻】

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本文編號：2707218