【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源、長(zhǎng)度為22nt左右,在多種真核生物中調(diào)控基因表達(dá)的非編碼小RNA。在植物中,它參與了許多生物過(guò)程,包括植物的生長(zhǎng)、發(fā)育及生物與非生物脅迫(包括病害,寒冷,高鹽,干旱等)響應(yīng)。小麥?zhǔn)侨藗冎饕募Z食作物之一,在世界各地均能生產(chǎn)。寒脅迫對(duì)小麥等經(jīng)濟(jì)作物的生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量有極負(fù)面的影響。東北農(nóng)業(yè)大學(xué)自主培育出了能克服黑龍江地區(qū)高寒氣候條件的強(qiáng)耐寒品種“東農(nóng)冬麥1號(hào)”(Dn1)(返青率高達(dá)85%),有著重要抗寒相關(guān)miRNA資源。從miRNA方向研究其寒脅迫下的糖代謝應(yīng)答機(jī)制,對(duì)于豐富小麥抗寒理論、培育抗寒品種具有重要的理論和實(shí)踐意義。本研究以大田自然降溫條件下種植Dn1為基礎(chǔ)材料,探討低溫對(duì)小麥糖代謝相關(guān)miRNA即tae-miR5049-3p、tae-miR1120a,及其靶基因6PGL和FBA表達(dá)模式的影響。使用花序侵染法,將pre-tae-miR5049-3p轉(zhuǎn)化到野生型擬南芥(哥倫比亞型)中。驗(yàn)證擬南芥中tae-miR5049-3p及其靶基因的表達(dá)模式,并檢測(cè)擬南芥的生理指標(biāo)。得到以下主要結(jié)果:(1)在自然降溫的四個(gè)溫度區(qū)(5℃,0℃,-10℃,-25℃)下,Dn1的tae-miR5049-3p和tae-miRNA1120a表達(dá)模式為:分蘗節(jié):隨著溫度降低,miR5049-3p的表達(dá)量呈先升高后降低的變化規(guī)律,而miR1120a的表達(dá)量則呈“升-降-升”的變化規(guī)律,二者均在0℃時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高;葉片中:隨著溫度降低,miR5049-3p呈“先升后降”的趨勢(shì),-10℃表達(dá)量最高,5℃時(shí)相對(duì)表達(dá)最低;miR1120a則隨著溫度的降低表達(dá)量逐漸升高(-25℃達(dá)到最高)。靶基因:6PGL和FBA分別與其對(duì)應(yīng)的tae-miR5049-3p和tae-miRNA1120a呈負(fù)調(diào)控表達(dá)關(guān)系。(2)生物信息學(xué)分析結(jié)果初步揭示了6PGL和FBA基因編碼的蛋白的結(jié)構(gòu),得知1)6PGL和FBA所編碼的蛋白分別具有其典型結(jié)構(gòu)域;其中6PGL的氨基酸序列中含有SugarP_isomerase superfamily結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域是典型的磷酸糖異構(gòu)酶家族結(jié)構(gòu)域,而磷酸糖異構(gòu)酶家族就包含6PGL。而FBA蛋白質(zhì)則具有典型的ICL_KPHMT superfamily結(jié)構(gòu)域是果糖二磷酸醛縮酶域結(jié)構(gòu)。2)6PGL和FBA蛋白可能分別定位于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)且為非分泌型蛋白。3)6PGL蛋白主要以多種空間結(jié)構(gòu)組合而成;而FBA蛋白的3D結(jié)構(gòu)主要以螺旋為主。(3)利用花序侵染法成功轉(zhuǎn)染擬南芥,獲得ox-pre-miR5049-3p轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(T3代)。對(duì)其進(jìn)行4℃低溫脅迫24 h處理后,檢測(cè)miR5049-3p及其靶基因6PGL的表達(dá),顯示兩者負(fù)向調(diào)控;同時(shí),檢測(cè)其轉(zhuǎn)基因植株的生理指標(biāo)(葉綠素含量,傷害率,MDA含量),表明ox-pre-miR5049-3p轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性高于野生型。通過(guò)RT-PCR及過(guò)表達(dá)植株驗(yàn)證,本研究證實(shí)了低溫脅迫下,tae-miR5049-3p能通過(guò)降低自身表達(dá)量負(fù)向調(diào)控6PGL的表達(dá)量升高,從而介導(dǎo)糖代謝途徑提高植株抗寒性。本研究初步揭示了miRNA調(diào)控Dn1糖代謝響應(yīng)冷脅迫的機(jī)制,對(duì)于強(qiáng)抗寒冬小麥新品種的分子育種,具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。
【圖文】：

與分析控糖代謝的抗寒相關(guān) miRNAs 及其靶基因的表達(dá)模 的總 RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄 所示，用 1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)的提取 5℃、0℃、-10℃、-25℃下 Dn1 分蘗節(jié)。使用超微紫外分光光度計(jì)檢測(cè) RNA 質(zhì)量，數(shù)據(jù)顯示每個(gè)樣品總 RNA 提圍內(nèi)，可以用于接下來(lái)的 cDNA 模板合成。通過(guò) miRNA 通用的反轉(zhuǎn)錄引 Dn1 樣品總 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，，分別得到每個(gè)樣品的 miRNA cDNA 第一

iR5049-3p（A1），miR1120a（A2）成熟體、6PGL（B1）及 FBA（B2）的增產(chǎn)物3-2 PCR products of miR5049-3p ( A1 )、 miR1120a ( A2 )、6PGL（B1）an（B2）表 3-1 擴(kuò)增 miRNA 及其靶基因的引物序列Table 3-1 Reaction sequence of primers used in qRT-PCR引物名稱 引物序列5049-3pF1120aF6PGLF6PGLRFBAFFBARactinFactinR5’-AATATGGATCGGAGGGAGTAC-3’5’-ACATTCTTATATTATGAGACGGAG-3’5’- CTGGAGACGGTTGACTGGAG -3’5’-GGCATCATTGATAGCATACACTTG-3’5’-AAGACGGAGAATGAGGAGAAGG-3’5’-ACGGAGGTAGTAAGCAGGAATG-3’5’-CCTTAGTACCTTCCAACAGATGT-3’5’-CCAGACAACTCGCAACTTAGA-3’結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)分析后，得到低溫脅迫下 Dn1 分蘗節(jié)和葉片中的 miRNAs 及變化情況。結(jié)果表明， miR5049-3p 和 miR1120a 在分蘗節(jié)和葉片中均有表
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S512.11

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2707218