【摘要】：富含甘氨酸 RNA 結(jié)合蛋白(Glycine-rich RNA-binding Protein,GRPs)是一種N端具有一個或者多個RNA識別基序和C末端富含甘氨酸區(qū)域的結(jié)合蛋白,可以響應(yīng)外界刺激,參與植物應(yīng)激反應(yīng),調(diào)控植物的生長發(fā)育和提高植物的抗逆能力。本研究從中國櫻桃(Prunus pseudocerasus)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選得到3個GRP編碼基因,對其進行生物信息學(xué)分析,根據(jù)同源性比對結(jié)果,分別命名為PpcGRP4、PpcGRP6、PpcGRP7。利用實時定量 PCR 技術(shù)(Real-time PCR)分析PpcGRP4、PpcGRP6、PpcGRP7基因在低溫脅迫下中國櫻桃花芽和葉片中的表達特性。利用PCR技術(shù)分離了櫻桃PpcGRP4、PpcGRP6、PpcGRP7的cDNA基因全長序列,并構(gòu)建了植物表達載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)花序浸染法將3個基因分別轉(zhuǎn)入擬南芥中,初步研究該基因的功能,主要取得以下研究結(jié)果:1.根據(jù)測序結(jié)果,獲得注釋為富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白基因序列,利用NCBI在線分析軟件Open Read Frame Finder分析了基因開放閱讀框,PpcGRP4、PpcGRP6、PpcGRP7分別編碼141、140和179個氨基酸。從其氨基酸數(shù)量、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)等生物信息學(xué)分析可知,PpcGRP6、PpcGRP7其等電點均大于7,均為堿性蛋白質(zhì)。PpcGRP4、PpcGRP6、PpcGRP7不穩(wěn)定指數(shù)分別為39.3、55.07、62.92。氨基酸分子量之間存在差異,而原子組成、脂肪指數(shù)和總平均疏水性等性質(zhì)差異不大,均為疏水性蛋白。對其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),這3個富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白都具有α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲、延伸鏈等結(jié)構(gòu)。而PpcGRP4和PpcGRP6以α螺旋所占比例較大。從TMHMM的跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果看,PpcGRP4、PpcGRP6和PpcGRP7的蛋白均無跨膜區(qū)域,蛋白基本都在膜外。蛋白的亞細胞定位預(yù)測結(jié)果表明:PpcGRP4主要定位在細胞核中,PpcGRP6主要定位在線粒體中,PpcGRP7在細胞質(zhì)中,且在細胞核、線粒體、細胞質(zhì)中的分布占有不同比例。通過與其它植物相關(guān)基因進行同源性比對發(fā)現(xiàn),它們與梅(Prunus mume)和碧桃(Prunus persica)的GRPs具有較高的親緣關(guān)系。2.利用 Real-time PCR 技術(shù)分別對 PpcGRP4、PpcGRPRP7基因在低溫脅迫下的中國櫻桃花芽和葉片中表達特性進行分析。結(jié)果表明,在低溫脅迫條件下,花芽和葉片中PpcGRP4、PpcGRP6和PpcGRP7基因的表達量均呈先上升后下降的趨勢,最高可上調(diào)34倍。由此認為PpcGRP4和PpcGRP6GRP7基因?qū)Φ蜏鼐哂忻黠@響應(yīng),但響應(yīng)程度存在明顯差異。PpcGRP7對低溫的相應(yīng)程度最高,PpcGRP6次之,最后是PpcGRP4。3.利用PCR技術(shù)分離了 PpcGRP4、PpcGRP6和PpcGRP7全長cDNA,并分別構(gòu)建了植物表達載體,利用花序浸染法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥,獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系T1代。以野生型擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子為實驗材料,進行種子萌發(fā)試驗。結(jié)果表明,種子萌發(fā)48 h時,超表達PpcGRP6和超表達PpcGRP7種子萌發(fā)率分別為38.9%和25.1%,而野生型種子萌發(fā)率為9.3%,超表達PpcGRP6和超表達PpcGRP7顯著促進種子萌發(fā)。但超表達PpcGRP4擬南芥種子的萌發(fā)率為14.8%與野生型擬南芥種子差異不顯著。4.為更加深入研究中國櫻桃PpcGRP4、PpcGRP6和PpcGRP7基因的功能,分別測定低溫處理不同時間下轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥中電解質(zhì)外滲率和丙二醛含量(Malondialdehyde,MDA)。結(jié)果表明,在低溫脅迫下,T1代轉(zhuǎn)基因植株葉片的電解質(zhì)外滲率和MDA都隨著時間的延長呈先上升后下降的趨勢,根據(jù)擬南芥葉片電解質(zhì)外滲率的變化率和擬南芥葉片8 h時MDA含量的積累量,推測中國櫻桃富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白基因PpcGRP4、PpcGRP6、PpcGRP7基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達可以增強細胞膜氧化能力,進而提高抗寒能力。通過以上研究結(jié)果,明確了部分中國櫻桃富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白基因的結(jié)構(gòu)特征、表達特性及功能,為植物抗逆研究提供一定的理論依據(jù)。
【圖文】：

１．２．１甘氨酸環(huán)逡逑對哺乳動物角蛋白富含甘氨酸片段進行核磁共振分析，結(jié)果表明這些富含甘逡逑氨酸片段可以呈現(xiàn)高度靈活的構(gòu)象（甘氨酸環(huán)）（圖１．１）［５］。通過對分散的非甘氨酸逡逑殘基的排列重組，甘氨酸環(huán)基元可以組織成一個天鵝絨狀結(jié)構(gòu)。但這種有序結(jié)構(gòu)逡逑很容易被中等應(yīng)力或張力所破壞，從而形成另一種類似的相互作用。在應(yīng)力結(jié)束逡逑時，這組相互作用被釋放以改變原結(jié)構(gòu)。在相同或相鄰的蛋白質(zhì)分子上相鄰甘氨逡逑酸環(huán)之間的多重相互作用可能構(gòu)成蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的基礎(chǔ)或亞細胞間結(jié)逡逑合的基礎(chǔ)擬南芥花藥特異性和表皮特異性ＧＲＰｓ中所提出的甘氨酸環(huán)結(jié)構(gòu)，逡逑可使這些蛋白質(zhì)具有更高的靈活性，而不需要明確的構(gòu)象。逡逑Ａ邐＾逡逑產(chǎn)邐．．邐Ｇ：邋；＠邐＃逡逑１１．邋Ｉ邋％邋％邋ｉ邋％邋ｉ邋％邋ｌ邋；＃邐．逡逑Ｇ＾［邋４＾邋４邋＾４＇＾邋，0４ｍＩ逡逑Ｉ邋％邋ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋！＾５邋１邋Ｉ逡逑％邋＾邐Ａ＾：．Ａ＇邐p悍埽鈴義賢跡保卞紋蔚母拾彼嶧方峁瑰義希疲椋紓澹保卞澹牽紓歟悖椋睿邋澹潁椋睿玨澹螅簦潁酰悖簦酰潁邋澹錚駑澹粒簦牽遙校叔澹媯潁幔紓恚澹睿翦義希保玻插澹ǎ常鄣義霞阜菅芯勘礱鰨緩拾彼岬慕峁褂虻畝督峁箍贍芤裕穡鄣男問醬嬖�，辶x細茫校鄣剎煌康姆雌叫辛醋槌傘８媚Ｐ褪腔冢鄭牽停檳Ｐ吞岢齙，

本文編號：2706869