【摘要】：研究背景:無毛基因(Hr)是Jumonji家族中的成員之一,定位于14號染色體上的D_2區(qū),在染色體上跨越14 kb,包含20個外顯子和18個內含子,主要編碼1182個氨基酸,基因長度為19486 bp,其表達產(chǎn)物為約127 kDa的無毛蛋白(hairless protein,HR)。HR功能的缺失可引起毛囊解體,外根鞘細胞凋亡數(shù)目顯著增多,導致大部分外根鞘結構被破壞,擾亂毛發(fā)的正常生長周期,使新毛發(fā)的形成受阻。目前對Hr基因的相關研究較少,我們不能斷定它的確切功能,但是Hr基因突變能夠導致昆明小鼠毛發(fā)脫落并保持終身無毛狀態(tài),因此豫醫(yī)無毛小鼠可以作為我們研究毛發(fā)生長調控機制的模型。目的:探索Hr基因的基因功能。研究Hr基因突變對昆明小鼠皮膚中分子機制的影響,探究豫醫(yī)無毛小鼠表型發(fā)生變化的原因。研究方法:(1)構建Hr基因過表達載體,將構建成功的過表達載體通過脂質體轉染的方式轉染進小鼠成纖維細胞(NIH3T3)中,利用Western Blot研究轉染后細胞內HR蛋白的過表達效果,通過流式細胞術研究轉染后細胞的增殖和凋亡情況,。(2)RNA干擾實驗:體外合成siRNA,將siRNA轉染進小鼠成纖維細胞(NIH3T3),利用Western Blot研究轉染后細胞內HR蛋白的表達效果,通過流式細胞術研究RNA干擾組細胞增殖和凋亡情況。(3)差異蛋白質組學:通過雙向電泳及生物質譜技術篩選2月齡和6月齡野生昆明小鼠和豫醫(yī)無毛小鼠皮膚中差異表達的蛋白,并對這些差異蛋白進行GO和KEGG分析,利用Western Blot對蛋白組學檢測結果進行驗證。結果:(1)pEGFP-Hr-M和pEGFP-Hr-N重組載體構建成功,經(jīng)脂質體轉染進入小鼠成纖維細胞后,HR蛋白表達量顯著提高,但是對細胞的增殖和凋亡沒有顯著影響。(2)將四組特異的siRNA導入細胞后,HR蛋白表達量均降低,其中第二組siRNA靶點效果最好,但是對細胞的增殖和凋亡沒有顯著影響。(3)通過凝膠雙向電泳檢測得到的電泳圖譜,找到其中存在差異表達的蛋白點有850個,選出其中差異較大的部分蛋白點做質譜鑒定,鑒定成功的蛋白點有26個。(4)對鑒定出來的26個點進行GO分析,對這些蛋白質的生物學進程進行分析,發(fā)現(xiàn)它們主要參與細胞進程:15%;單一的生物過程:14%;應激:12%;代謝過程:12%;細胞組分:9%;多細胞的生物過程:8%;發(fā)展過程:8%。從細胞組分來分析,有24%的差異蛋白被定位于細胞內,22%被定位于細胞器中,19%被定位于細胞外,11%被定位于大分子復合物中,其它還有少部分被定位于膜上、膜蛋白等處。根據(jù)分子功能分類,這些蛋白有50%具有結合作用,22%具有催化活性,10%具有結構分子活性,剩下的部分分別具有分子功能調節(jié)作用、抗氧化活性、分子轉導活性和電子載體活性。(5)對這些差異點進行KEGG分析,結果顯示差異基因主要分布在雌激素信號轉導通路、抗原的處理與表達、內質網(wǎng)蛋白的加工和程序性壞死通路。(6)對其中的兩個與皮膚和毛發(fā)相關的差異蛋白:角蛋白17(KRT17)和Ⅲ型膠原蛋白(COL3A1)進行驗證,結果與雙向電泳結果一致。豫醫(yī)無毛小鼠2月齡和6月齡皮膚中的KRT17表達量確實高于野生昆明小鼠2月齡和6月齡的皮膚。豫醫(yī)無毛小鼠2月齡的皮膚中COL3A1高于同時期的野生昆明小鼠,但是其6月齡小鼠皮膚中COL3A1低于同時期的野生昆明小鼠。結論:(1)Hr基因過表達和敲低均不會影響小鼠成纖維細胞(NIH3T3)的增殖和凋亡。(2)雙向電泳檢測出的差異蛋白有850個,然后選取部分點經(jīng)過生物質譜分析和生物信息學分析,找出了26個差異蛋白,這些差異蛋白主要集中在雌激素信號轉導通路、抗原的處理與表達、內質網(wǎng)蛋白的加工和程序性壞死相關通路,Hr基因的突變影響了小鼠體內的相關通路。(3)Hr基因突變上調了KRT17的表達量,KRT17表達量的增加導致了無毛小鼠的皮膚狀態(tài)發(fā)生變化。Hr基因的突變也影響了膠原蛋白的表達,使得COL3A1在2月齡豫醫(yī)無毛小鼠皮膚中的表達量升高,但是其在6月齡豫醫(yī)無毛小鼠皮膚中的表達量降低,導致皮膚衰老等一系列變化。
【圖文】：

因在小鼠 14號染色體f hairless genes in mous無毛蛋白（ hairless位區(qū)（ nuclear matr localization signal，2）[8]。無毛蛋白的功有一個鋅指結構，編化[9-11]。HR功能的大部分外根鞘結構破]。通過病理學實驗觀整的毛囊結構，而是不能上移，毛發(fā)生長控毛發(fā)生長發(fā)育周

圖 1.1 無毛基因在小鼠 14號染色體的位置Figure 1.1 Location of hairless genes in mouse chromosome 14無毛基因的表達產(chǎn)物被稱為無毛蛋白（ hairless protein， HR），含有四個常重要的結構域， 為核基質定位區(qū)（ nuclear matrix targeting signal，TS）、核定位序列（ nuclear localization signal，， NLS）、富含半胱氨酸鋅結構域和 JmjC結構域（圖 1.2）[8]。無毛蛋白的功能目前仍然不是很清楚，是有數(shù)據(jù)顯示，無毛基因部位有一個鋅指結構，編碼著高表達于腦部和皮膚的轉錄因子，表達呈周期性變化[9-11]。HR功能的缺失可引起毛囊解體，外細胞凋亡數(shù)目顯著增多，導致大部分外根鞘結構破壞，毛發(fā)的生長周期不能常運行，新的毛發(fā)形成受阻[5]。通過病理學實驗觀察皮膚組織切片，研究者現(xiàn) Hr 基因突變小鼠已沒有完整的毛囊結構，而是形成許多囊腫，以后也沒新的毛囊形成，真皮乳頭滯留不能上移，毛發(fā)生長信號中斷，毛發(fā)不能重新長[8]�？梢�，Hr 基因功能對調控毛發(fā)生長發(fā)育周期意義重大。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q78

【參考文獻】

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本文編號：2706489