【摘要】：磷脂是生命的基礎物質,是人類及動植物組織細胞膜的重要組成成分,是人體正常代謝與健康生存不可缺少的物質同時磷脂酰膽堿也是植物生長發(fā)育的重要代謝物,也是植物細胞膜主要脂質組分。大豆磷脂酰甲基轉移酶(GmPLMT)存在于大豆磷脂酰膽堿合成途徑中,是卵磷脂合成的關鍵酶。為了探明大豆中GmPLMT基因具體功能,為大豆種質的改良提供備選基因,本研究從吉育72號大豆中克隆了得到了GmPLMT基因,構建植物表達載體并進行擬南芥和大豆的遺傳轉化,獲得轉基因植株后進行基因表達量及生理生化指標的測定,與非轉基因植株的基因表達量生理生化指標共同分析。試驗結果表明:(1)通過常規(guī)PCR方法,利用NCBI中序列設計特異性引物,成功從吉育72號大豆中成功克隆GmPLMT基因全長cDNA序列,包括完整ORF序列504bp,與NCBI中的GmPLMT序列一致。(2)構建了植物表達載體pCAMBIA3301-GmPLMT,并通過農桿菌介導轉化擬南芥和大豆,采用草丁膦除草劑篩選法、PCR鑒定法、southern雜交法共同驗證,證明成功獲得大量T3代擬南芥和1株T1代轉基因大豆,并證明GmPLMT基因以單拷貝形式整合入了大豆和擬南芥基因組中,其中在擬南芥基因組中整合位置不同。(3)利用熒光定量PCR法測定大豆不同生育時期中成熟期的根中的GmPLMT基因表達量最高為0.66是同時期葉片的7.4倍,說明GmPLMT基因在成熟期大豆中主要表達于根部;在大豆種子成熟過程中,每隔5天取一次樣品,共采樣10次,種子中GmPLMT基因的變化呈先升高后降低的趨勢,第一次樣品基因表達量為0.061之后逐漸降低至第四次樣品的0.004,也是整個大豆成熟過程中的最低值,之后逐漸升高,在第八次達到最大值0.25之后含量迅速降低至0.061,可知GmPLMT基因表達量在大豆種子逐漸成熟過程中呈動態(tài)變化;測定大豆種子中磷脂類(磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇)、脂肪酸的含量,并通過相關性分析發(fā)現(xiàn)不同成熟度大豆種子中GmPLMT基因與磷脂酰膽堿含量呈顯著正相關,相關系數(shù)為0.5,磷脂酰膽堿含量與亞油酸、亞麻酸均呈顯著正相關,相關系數(shù)分別為0.74和0.82,可見GmPLMT基因的表達量提高能夠直接的增加大豆種子中磷脂酰膽堿和脂肪含量,間接提高大豆種子中多不飽和脂肪酸的含量。(4)利用熒光定量PCR法測定轉基因T3代擬南芥不同生育時期GmPLMT基因的表達量,開花期GmPLMT基因表達量最高達到了0.139,成熟期最低為0.054,僅為開花期的38.8%,可見轉基因T3代擬南芥中開花期基因表達量最高。多種生化方法測定轉基因擬南芥種子中磷脂類、脂肪酸的含量、粗脂肪含量,與野生型擬南芥種子對照中看出,轉基因擬南芥中總磷質,磷脂酰膽堿,磷脂酰乙醇胺含量大幅度提高分別為2.02倍、2.09倍、1.36倍;亞油酸,亞麻酸的含量均有提高,提高比例分別為4.51%和3.39%。與在大豆中相關性分析結果一致。可見通過轉基因提高GmPLMT基因的表達量不僅能夠大幅度提高磷脂酰膽堿及總磷質含量同時能夠提高植物種子內多不飽和脂肪酸的含量。
【圖文】：

Tab.2-8：Digestion of recombinant plasmidsMT 基因的克隆總 RNA 的提取提取到大豆葉片的總 RNA，并用 NANO DROP 2000 測.02。用 1%的瓊脂糖變性膠電泳，三條帶清晰，證明總于后續(xù)反轉錄以及 RT-PCR 實驗(見圖 2.1)。

GmPLMT重組質粒驗證M：DL2000DNAmarker；1：質粒PCR；2：菌液PCR；3：質粒雙酶切Fig.2.3GmPLMTrecombinantplasmidvalidationM：DL2000DNAmarker；1：RecombinantplasmidPCR；
【學位授予單位】：吉林農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;S565.1

【參考文獻】

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本文編號：2705355