【摘要】：研究背景和研究目的近年以來,伴隨著逐年升高的發(fā)病率,惡性腫瘤已成為人類主要死因之一,其中,在世界184個國家及地區(qū)中,中國的發(fā)病率位居中上水平[1],每年新增腫瘤病人達到了全球新發(fā)病例的21.8%,惡性腫瘤已對我國的居民健康和社會發(fā)展造成了重大威脅,對于惡性腫瘤的有效防治也成為我國面臨的重要公共衛(wèi)生問題。惡性腫瘤的形成和發(fā)展是一個多基因調(diào)控的復(fù)雜過程,在這個過程中關(guān)鍵的癌基因和/或抑癌基因發(fā)生表達失調(diào),對于這些基因的深入理解有助于從分子層面闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制,也可以促進人們對于惡性腫瘤的精準(zhǔn)防治。在眾多腫瘤調(diào)控基因中,銅代謝基因MURR1結(jié)構(gòu)域(Copper Metabolism MURR1 Domain,COMMD)家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個參與眾多腫瘤調(diào)控的蛋白家族。該家族共有10名成員,即COMMD1-COMMD10,研究發(fā)現(xiàn)COMMD1蛋白在多種腫瘤中低表達且與腫瘤的侵襲密切相關(guān)[2,3];COMMD5蛋白在膠質(zhì)母細胞瘤及腎細胞癌中表達下調(diào),在人胚胎腎細胞株HEK293中過表達COMMD5可減弱細胞的增殖能力[4];有7個COMMD家族成員被認為是BL41 Burkitt's淋巴瘤細胞株中EB病毒可能作用的靶點[5];近期又有研究顯示COMMD10蛋白在結(jié)直腸癌中低表達且與病人的不良預(yù)后相關(guān),COMMD10通過抑制NF-κB通路的活性來抑制結(jié)腸癌細胞的局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移[6],上述證據(jù)證明COMMD家族和多種腫瘤存在密切聯(lián)系。因為NF-κB通路的異�；罨驯蛔C實與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),而COMMD10在結(jié)腸癌細胞中可以抑制NF-κκB通路的活化,所以COMMD10可能在多種腫瘤中都發(fā)揮了重要作用,但目前關(guān)于COMMD10在人類其他腫瘤及對應(yīng)正常組織中的表達情況及生物學(xué)功能尚不清楚。本課題選取COMMD10作為研究靶點,初步探討COMMD10在人體重要正常組織、常見腫瘤組織以及常用實驗動物BALB/c小鼠中的表與分布,通過生物信息學(xué)方法挖掘探索其在腫瘤中可能發(fā)揮的生物學(xué)作用及參與的分子通路,為后續(xù)研究COMMD10在人類疾病中發(fā)揮的具體作用及相關(guān)作用機制奠定基礎(chǔ)。研究方法1.COMMD10在BALB/c小鼠不同正常組織中的表達與分布1.1 COMMD10 mRNA在BALB/c小鼠不同組織中的表達情況:提取BALB/c小鼠心、肺、大腦、胃、小腸、脾臟、肝臟、腎臟、胰腺、胸腺等10種新鮮冰凍正常組織中的mRNA,利用熒光定量PCR檢測COMMD10在BALB/c小鼠不同組織中的mRNA水平表達情況。1.2COMMD10蛋白在BALB/c小鼠不同正常組織中的分布情況:制作BALB/c小鼠心、肺、大腦、氣管、食管、胃、小腸、脾臟、肝臟、腎臟、胰腺、胸腺等12種正常組織的石蠟切片,利用免疫組織化學(xué)染色檢測COMMD10在BALB/c小鼠不同組織中的蛋白水平表達情況。2.COMMD10在人體正常組織及常見腫瘤組織中的表達與分布差異2.1 COMMD10蛋白在人體重要正常組織和常見腫瘤組織中的分布與表達:收集人體包括肺、食管、胃、肝、腎、結(jié)腸、直腸、乳腺、胎盤、前列腺、皮膚、甲狀腺、膀胱、宮頸、脾臟、子宮體等16種正常組織和包括肝細胞癌、膽管細胞癌、結(jié)腸腺癌、直腸腺癌、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、腎尿路上皮癌、腎透明細胞癌、腎嫌色細胞癌、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、食管鱗癌、甲狀腺乳頭狀癌、前列腺癌、鼻咽癌、胃腸間質(zhì)瘤、乳腺小細胞癌、乳腺葉狀腫瘤、肺腺癌、胸腺瘤、宮頸癌、膀胱尿路上皮癌等22種常見腫瘤組織標(biāo)本并制作石蠟切片,利用免疫組織化學(xué)染色檢測COMMD10蛋白在人體正常組織和常見腫瘤組織中的分布與表達。2.2 COMMD10在不同類型腫瘤和配對正常組織中的表達差異及與預(yù)后的相關(guān)性:利用TCGA數(shù)據(jù)庫資源分析COMMD10在不同類型腫瘤組織和配對正常組織中的表達差異及COMMD10的表達水平與患者總生存時間、疾病無進展生存時間的相關(guān)性。3.COMMD10基因的生物信息學(xué)挖掘3.1 COMMD10的基本信息及蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)分析:利用UCSC網(wǎng)站(http://genome.ucsc.edu/)分析 COMMD10 的基本信息,運用 STRING 網(wǎng)站(https://string-db.org/)來查找已被證實或可能的COMMD10關(guān)聯(lián)基因。3.2 COMMD10及其互作基因的聚類分析:利用DAVID網(wǎng)站(https://david.abcc.ncifcrf.gov/)對COMMD10及其互作基因進行功能聚類分析與KEGG通路分析。3.3 調(diào)控 COMMD10 的 miRNA 預(yù)測:用 miRDB(http://www.mirdb.org/),miRWalk(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/),Target Scan(http://www.targetscan.org/),microRNA(http://34.236.212.39/microRNA/home.do)這4個網(wǎng)站對可能調(diào)控COMMD10表達的miRNA進行預(yù)測,最終對4個預(yù)測結(jié)果取交集獲得目的miRNA。研究結(jié)果1.COMMD10在BALB/c小鼠不同正常組織中的表達與分布1.1 COMMD1O mRNA在BALB/c小鼠不同組織中的表達情況:在BALB/c小鼠的心臟、肺、大腦、胃、小腸、肝臟、脾臟、腎臟、胰腺、胸腺等10種組織中,COMMD10的mRNA均有不同程度的表達。其中,COMMD10在肺和脾臟組織中的表達顯著高于其他組織,在心臟及大腦組織中的表達顯著低于其他組織,胃、小腸、肝臟、腎臟、胰腺、胸腺等組織中COMMD10的表達無顯著差異。1.2COMMD10蛋白在BALB/c小鼠不同正常組織中的分布情況:COMMD10蛋白在BALB/c小鼠的胸腺組織中不表達,在心、肺、大腦、氣管、食管、胃、小腸、脾臟、肝臟、腎臟、胰腺等11種組織中均有不同程度的表達且主要定位于細胞漿中,其中在各組織的血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞可見COMMD10蛋白的普遍表達。2.COMMD10在人體正常組織及常見腫瘤組織中的表達與分布差異2.1 COMMD10蛋白在人體重要正常組織和常見腫瘤組織中的分布與表達:COMMD10蛋白在皮膚、甲狀腺、膀胱、宮頸、脾臟等5種組織不表達,在肺、食管、胃、肝、腎、結(jié)腸、直腸、乳腺、胎盤、前列腺、子宮體等11種正常組織中均有不同程度的表達,其中在胃、肝、腎組織中高表達,COMMD10蛋白主要定位于細胞漿中,但在肝細胞中,COMMD10蛋白可以同時在細胞漿和細胞核中表達。在腫瘤組織中,COMMD10蛋白在乳腺小細胞癌、乳腺葉狀腫瘤、肺腺癌、胸腺瘤、宮頸癌、膀胱尿路上皮癌等6種腫瘤組織中不表達,在鼻咽癌、胃腸間質(zhì)瘤等2種腫瘤組織中高表達,在肝細胞癌、膽管細胞癌、結(jié)腸腺癌、直腸腺癌、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、腎尿路上皮癌、腎透明細胞癌、腎嫌色細胞癌、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、食管鱗癌、甲狀腺乳頭狀癌、前列腺癌等14種腫瘤中低表達,COMMD10蛋白定位于腫瘤細胞的細胞漿中。2.2COMMD10在不同類型腫瘤和配對正常組織中的表達差異及與預(yù)后的相關(guān)性:COMMD10在肺鱗癌、浸潤性乳腺癌、腎透明細胞癌這3種腫瘤組織中的表達水平與配對正常組織存在顯著差異,COMMD10在浸潤性乳腺癌組織中的表達上調(diào),在肺鱗癌、腎透明細胞癌組織中的表達下調(diào)。在腎透明細胞癌中,COMMD10高表達的患者總生存時間顯著高于COMMD10低表達的患者,COMMD10的低表達預(yù)示著腎透明細胞癌患者的不良預(yù)后。3.COMMD10基因的生物信息學(xué)挖掘3.1 COMMD10的基本信息及蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)分析:運用STRING網(wǎng)站對COMMD10進行蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)分析,結(jié)果顯示有41個基因與COMMD10關(guān)聯(lián),這些基因分別是 RBX1、ATP7B、SLC31A2、C14orf1 66、TCEB2、COMMD9、CP、COMMD4、COMMD10、COMMD7、ATP11A、ZER1、ARAP2、COMMD5、MORN4、COMMD1、DSCR3、ATOX1、ASB4、PSMG1、PNRC2、WARS、COMMD6、NPEPL1、CCDC151、MCMBP、FAM45A、SLC31A1、TFDP1、IARS、CCDC22、CCDC93、COMMD3、COMMD8、VPS29、ENSG00000215700、RELA、C16orf62、SH3GLB1、COMMD2、CUL2 等。3.2 COMMD1O及其互作基因的聚類分析:運用DAVID網(wǎng)站(https://david.abcc.ncifcrf.gov/)對COMMD10及其互作基因進行功能富集分析,結(jié)果顯示COMMD10及其互作基因主要參與形成Cullin-RING泛素連接酶復(fù)合體、核內(nèi)體等細胞成分,其富集的分子功能主要指向:銅離子的結(jié)合及轉(zhuǎn)運,與泛素化蛋白連接酶結(jié)合并調(diào)控其活性,調(diào)控NF-κB通路等,其參與的生物學(xué)過程主要包括:銅離子的運輸及穩(wěn)態(tài)維持,DNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白質(zhì)的運輸,負向調(diào)節(jié)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性;在KEGG通路分析中,這些基因被發(fā)現(xiàn)與腎細胞癌中的通路、HIF-1信號通路、泛素化介導(dǎo)的蛋白水解、胞吞作用、礦物質(zhì)吸收等相關(guān)。3.3 調(diào)控 COMMD1O 的 miRNA 預(yù)測:使用 miRDB(http://www.mirdb.org/),miRWalk(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/),Target Scan(http://www.targetscan.org/),microRNA(http://34.236.212.39/microRNA/home.do)這4個網(wǎng)站對可能調(diào)控COMMD10表達的miRNA進行預(yù)測,在miRDB數(shù)據(jù)庫中得到24個相關(guān)的miRNA,在microRNA數(shù)據(jù)庫中得到27個相關(guān)的miRNA,在Target Scan數(shù)據(jù)庫中得到566個相關(guān)的miRNA,在miRWalk中得到1430個相關(guān)的miRNA,最終對4個預(yù)測結(jié)果取交集得到1個共同的miRNA:hsa-miR-590-3p。結(jié)論1.COMMD1O mRNA在BALB/c小鼠的重要組織中均有表達,在脾臟和肺組織中表達最高,心臟及大腦組織中表達最低。2.COMMD10蛋白在BALB/c小鼠的胸腺組織中不表達,在其他重要組織中均有不同程度的表達,主要定位于細胞漿。3.COMMD10蛋白在人體正常的胃、肝、腎組織中高表達,在血管內(nèi)皮及平滑肌組織普遍表達,其中在正常肝細胞中同時定位于細胞漿和細胞核,在其它細胞中均于細胞漿表達。此外COMMD10蛋白在多種常見人體腫瘤組織中也有不同程度的表達,主要定位于腫瘤細胞細胞漿中。4.COMMD10預(yù)示著腎透明細胞癌的良好預(yù)后。創(chuàng)新性1.首次從mRNA及蛋白水平闡述COMMD10在BALB/c小鼠不同組織中的表達及分布情況。2.首次提出COMMD10在腎透明細胞癌中可能具有抑癌作用。3.預(yù)測COMMD10在腎透明細胞癌中可能的作用機制。
【圖文】：

博士學(xué)位論文邐逡逑，ＣＯＭＭＤ１０仍定位于細胞漿中；膀胱組織中正常上皮細胞均未見ＣＯＭＭＤ１０逡逑達；宮頸組織中淲狀上皮也不表達ＣＯＭＭＤ１０；子宮體組織中平滑肌組織及逡逑管內(nèi)皮可見ＣＯＭＭＤ１０低表達，ＣＯＭＭＤ１０定位于細胞漿中。此外，在皮膚逡逑織中，淲狀上皮未見ＣＯＭＭＤ１０表達；在乳腺組織中，牙管上皮細胞可見逡逑ＭＭＤ１０低表達，脂肪細胞可見ＣＯＭＭＤ１０中度表達，，ＣＯＭＭＤＩＯ均于細胞逡逑中表達。在胎盤組織中，血管內(nèi)皮細胞可見ＣＯＭＭＤ１０蛋白中度表達且定位逡逑細胞質(zhì)，絨毛滋養(yǎng)葉細胞未見ＣＯＭＭＤＩＯ蛋白表達。在甲狀腺組織中，濾泡逡逑皮未見ＣＯＭＭＤＩＯ蛋白表達。在脾臟組織中未見ＣＯＭＭＤＩＯ蛋白表達（圖逡逑１）。逡逑１０0Ｘ邐４０0ｘ邐１０0ｘ邐４０0ｘ逡逑＂＂＂

上皮癌、腎透明細胞癌、腎嫌色細胞癌、前列腺癌、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜癌、逡逑胃癌、食管鱗癌、甲狀腺乳頭狀癌等１４種腫瘤中可見腫瘤細胞ＣＯＭＭＤ１０蛋白逡逑低表達（圖２－２）；鼻咽癌、胃腸間質(zhì)瘤這２種腫瘤中可見腫瘤細胞ＣＯＭＭＤ１０逡逑蛋白高表達（圖２－３）。此外，我們發(fā)現(xiàn)在所有表達ＣＯＭＭＤ１０蛋白的腫瘤組逡逑？織中，ＣＯＭＭＤ１０均定位于腫瘤細胞的細胞漿中。逡逑２０逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q811.4;R73

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本文編號：2704806