【摘要】：目的:據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計,全球每年新發(fā)癌癥病例高達900萬以上,死亡500萬,且有逐年增加趨勢。胃癌是常見的惡性腫瘤之一,僅次于肺癌、肝癌居癌癥發(fā)病率的第三位。我國是胃癌的高發(fā)區(qū),發(fā)病率占全世界42%,年死亡人數(shù)為16萬人,近年來中青年人胃癌的發(fā)病率呈上升趨勢。胃癌確診時常常進展到中晚期,不僅失去了手術治療的機會,也增加了放、化療的難度,預后極差,5年生存率大大降低。胃癌的主要死因是癌細胞的廣泛侵襲和轉(zhuǎn)移,特別是難以控制的遠隔重要臟器的轉(zhuǎn)移。因此,深入了解胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移相關分子機制,尋找敏感、特異的侵襲、轉(zhuǎn)移標志物,對于控制胃癌的遠隔臟器轉(zhuǎn)移,提高患者生存期具有重要的臨床意義。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個復雜的過程,涉及多個基因質(zhì)和量的改變。研究表明,腫瘤的轉(zhuǎn)移與腫瘤轉(zhuǎn)移相關基因的激活或轉(zhuǎn)移抑制基因的失活有關。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因是在分子克隆技術發(fā)展的基礎上提出的,此類基因在非轉(zhuǎn)移腫瘤中呈高表達,在轉(zhuǎn)移腫瘤中低表達,但不影響腫瘤的發(fā)生。Kiss-1基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因,與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關。kiss-1基因相關肽kisspeptins與受體GPR54結合,抑制多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移,如人黑色素瘤、膀胱癌、腎癌;卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、絨毛膜癌;食管癌、胃癌等。kiss-1基因的表達缺失與上述腫瘤的惡性程度增高、轉(zhuǎn)移能力增強、治療效果差和預后不良呈正相關。kiss-1基因作為一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因,在抑制細胞增殖,增加細胞粘附力,促進凋亡等方面影響腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲能力,這其中涉及多條信號通路并受到諸多因素精細調(diào)控,有望成為抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療的新靶點。截至目前,關于kiss-1基因表達與胃癌轉(zhuǎn)移關系的報道尚不多見,其作用機制仍不清楚。本實驗分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中kiss-1表達與臨床病理數(shù)據(jù)和預后的關系得出kiss-1基因低表達與胃癌臟器轉(zhuǎn)移密切相關這一結論,并利用基因工程技術構建kiss-1基因高表達載體并轉(zhuǎn)染胃癌細胞系,通過體內(nèi)、外實驗全面評估kiss-1基因?qū)ξ赴┘毎脑鲋�、遷移、侵襲能力的影響,進而揭示kiss-1基因與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移關系及相關機制。研究方法:1分析TCGA數(shù)據(jù)庫中kiss-1表達與臨床病理因素及預后的關系1.1從Cancer Genome Atlas(TCGA)(http://www.cbioportal.org/)數(shù)據(jù)庫下載354名胃癌患者的kiss-1mRNA表達量,區(qū)分kiss-1低表達與高表達的cut-off值設定為8.85FPKM,使用SPSS軟件對臨床病理參數(shù)和預后進行相關性分析。1.2胃癌組織和胃癌細胞株的收集:選取中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科手術切除胃癌標本及配對遠癌正常胃粘膜標本,共10對,標本離體后盡快取材,置于去RNA酶的Eppendorf管中,-80℃保存?zhèn)溆�。收�?種胃癌細胞系BGC823、MGC803、SGC7901、NCI-N87、MKN45,置于去RNA酶的Eppendorf管中,-80℃保存?zhèn)溆谩?.3 qRT-PCR方法檢測人胃癌組織、配對遠癌正常胃粘膜組織和胃癌細胞株kiss-1基因的mRNA,初步評估kiss-1基因在胃癌組織和正常胃粘膜組織的表達水平并篩選kiss-1基因呈低表達的細胞作為轉(zhuǎn)染的候選細胞系。2 Kiss-1基因重組真核表達載體構建、鑒定及穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細胞克隆篩選2.1采用PCR技術從前期構建好的質(zhì)粒中獲得kiss-1片段,通過基因克隆技術構建pEGFP-C1-kiss-1重組子,并經(jīng)雙酶切及測序鑒定。采用氯化鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli Competent Cell JM109,小量提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定,最后中等量提取pEGFP-C1-kiss-1質(zhì)粒,-20℃保存?zhèn)溆谩?.2應用Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染BGC823胃癌細胞,FCM和G418兩種方法雙重篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性克隆,分別命名為pEGFP-C1BGC823(BGC823/vector)和pEGFP-kiss-1BGC823(BGC823/kiss-1),經(jīng)qRT-PCR和Western blot方法檢測BGC823胃癌細胞kiss-1基因的表達情況。3 Kiss-1基因?qū)GC823胃癌細胞生物學特性的影響及其機制研究3.1檢測高表達kiss-1基因?qū)GC823胃癌細胞生物學特性的影響:MTT法連續(xù)6天測定BGC823、BGC823/vector和BGC823/kiss-1三組細胞的490nm吸光度值,計算相對增殖率,繪制增殖曲線;FCM檢測細胞周期和凋亡的變化;劃痕愈合實驗和Transwell小室評估kiss-1基因?qū)毎w移和侵襲能力的影響;平板克隆形成實驗觀察kiss-1基因能否抑制細胞克隆形成能力。3.2Western blot方法檢測kiss-1基因影響胃癌細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及血管生成的相關蛋白:ERK1/2/p-ERK、Akt/p-AKT、YAP1、MMP9、VEGF、Sp1和αE-catenin。4 Kiss-1基因?qū)ξ赴┘毎胁ド⑴K器轉(zhuǎn)移和裸鼠皮下移植瘤生長的影響及機制研究4.1采用BGC823、BGC823/vector和BGC823/kiss-1胃癌細胞分別建立BALB/C裸小鼠皮下移植瘤模型,每組接種3只裸鼠,共9只;將BGC823/vector對照組和BGC823/kiss-1實驗組胃癌細胞分別行尾靜脈注射建立裸鼠體內(nèi)血行播散模型,每組接種3只裸鼠,共6只。4.2每周量取皮下移植瘤大小,連續(xù)測量5周,計算瘤體積,繪制移植瘤生長曲線,計算抑制率。裸鼠荷瘤5周處死,完整剝離皮下瘤,稱取瘤重。計算成瘤率,比較皮下瘤的體積和瘤重的組間差異。4.3制作裸鼠皮下移植瘤和血行播散模型裸鼠肝臟、肺臟常規(guī)石蠟切片,HE染色后觀察瘤組織的形態(tài)學特點及EGFP表達情況。4.4免疫組織化學方法檢測皮下瘤的kiss-1、YAP1、ki67、CD31、VEGF和Sp1的表達。Weidner計數(shù)標準檢測CD31陽性細胞數(shù)用來評判微血管密度(MVD)。熒光顯微鏡下計數(shù)血行播散模型裸鼠肝、肺轉(zhuǎn)移瘤灶(臟器最大橫切面),比較組間轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。5統(tǒng)計分析結果用SPSS for windows 17.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析。結果:1 Kiss-1基因低表達與臟器遠隔轉(zhuǎn)移相關,與正常胃粘膜組織及GES-1相比,人胃癌組織和BGC823胃癌細胞系kiss-1基因表達下調(diào)1.1胃癌患者kiss-1基因低表達與臟器遠隔轉(zhuǎn)移密切相關(P0.05)。1.2胃癌組織kiss-1基因表達水平低于配對的正常胃粘膜組織(P0.05)。1.3 5種胃癌細胞系BGC823,MGC803,SGC7901,NCI-N87,MKN45中,BGC823細胞kiss-1基因mRNA水平低于其他四種細胞系,選取該細胞系作為kiss-1基因轉(zhuǎn)染的候選細胞系。2成功構建了kiss-1基因重組真核表達載體,轉(zhuǎn)染胃癌細胞并篩選出一株穩(wěn)定表達kiss-1基因的細胞克隆2.1雙酶切及測序鑒定證明成功構建pEGFP-C1-kiss-1真核表達載體。2.2 qRT-PCR和Westernblot方法證實脂質(zhì)體介導的并經(jīng)FCM和G418兩種方法雙重篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性克隆kiss-1基因呈高表達,并命名為BGC823/kiss-1。3 Kiss-1基因在體外可顯著抑制BGC823胃癌細胞的增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力,誘導G0/G1期阻滯及凋亡,顯著下調(diào)YAP1、pERK 1/2、pAkt、MMP-9、VEGF和Sp1蛋白表達,上調(diào)αE-catenin的表達3.1 MTT法體外增殖實驗中,結果顯示BGC823/kiss-1實驗組胃癌細胞體外增殖能力與BGC823/vector對照組和BGC823對照組相比明顯下降,統(tǒng)計學差異非常顯著(P0.01)。3.2 FCM測定實驗組和對照組胃癌細胞周期結果顯示,與BGC823/vector對照組和BGC823對照組相比,BGC823/kiss-1實驗組胃癌細胞出現(xiàn)G0/G1阻滯,并且差異非常顯著(P0.01)。3.3 FCM檢測實驗組與對照組癌細胞凋亡水平結果顯示,BGC823/kiss-1實驗組早期凋亡檢出率高于BGC823/vector對照組和BGC823對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.4劃痕愈合實驗結果顯示,BGC823/kiss-1實驗組在24h、48h和72h三個時間點的劃痕寬度與BGC823/vector對照組和BGC823對照組相比顯著縮窄,統(tǒng)計學差異顯著(P0.05)。3.5 Transwell小室侵襲實驗結果顯示,與BGC823/vector對照組和BGC823對照組相比,BGC823/kiss-1實驗組穿膜細胞數(shù)明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。3.6平板克隆形成實驗結果顯示,與BGC823/vector對照組和BGC823對照組相比較,BGC823/kiss-1組克隆形成率明顯減少,統(tǒng)計學差異非常顯著(P0.01)。3.7 WB檢測結果顯示,BGC823/kiss-1實驗組總ERK1/2和Akt蛋白表達無明顯變化,但磷酸化的p-ERK1/2和p-Akt表達水平下降;YAP1、MMP-9、VEGF及Sp1表達降低,αE-catenin呈高表達。4 Kiss-1基因在體內(nèi)可顯著抑制裸鼠胃癌皮下移植瘤的生長,抑制血行播散胃癌細胞肺、肝轉(zhuǎn)移瘤形成,其機制與下調(diào)YAP1、Sp1、VEGF蛋白表達,降低皮下移植瘤微血管密度有關4.1裸鼠皮下荷瘤實驗結果顯示:對照組與實驗組裸鼠荷瘤率均為100%,BGC823/kiss-1實驗組組皮下瘤體積和瘤重均小于BGC823/vector對照組和BGC823對照組(P0.05),而BGC823/vector和BGC823兩個對照組間皮下瘤體積和瘤重差異不大。4.2皮下瘤免疫組化檢測結果顯示:BGC823/kiss-1實驗組皮下瘤細胞kiss-1蛋白呈陽性表達,BGC823/vector對照組和BGC823對照組皮下瘤細胞kiss-1基因呈陰性表達。BGC823/kiss-1實驗組皮下瘤細胞YAP1、SP1和VEGF表達強度顯著低于對照組(P0.05)。而對照組的MVD明顯高于BGC823/kiss-1實驗組(P0.05)。4.3胃癌細胞體內(nèi)血行播散模型裸鼠肺臟和肝臟轉(zhuǎn)移灶計數(shù)結果顯示:BGC823/vector對照組的3只裸鼠肺和肝均可見轉(zhuǎn)移灶,肺部生長活躍轉(zhuǎn)移瘤平均為5.5個,最多者見到7個;肝臟可疑微小轉(zhuǎn)移灶平均為4.3個,最多者見到5個。BGC823/kiss-1實驗組僅1只鼠肺內(nèi)發(fā)現(xiàn)4個血管內(nèi)癌栓及肝臟發(fā)現(xiàn)2個可疑靜脈微小癌栓;其余2只鼠的肺、肝均未見轉(zhuǎn)移。結論:1、TCGA數(shù)據(jù)庫分析kiss-1表達水平與胃癌臟器轉(zhuǎn)移相關。與正常人胃粘膜上皮組織細胞相比較,胃癌組織和BGC823胃癌細胞中,轉(zhuǎn)移抑制基因kiss-1表達顯著下調(diào)。2、成功構建了穩(wěn)定高表達kiss-1基因的胃癌細胞株BGC823/kiss-1。3、Kiss-1基因高表達在體外可顯著抑制BGC823胃癌細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力,其機制可能與誘導G0/G1期阻滯和細胞早期凋亡、抑制ERK1/2、PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導通路活性、影響YAP1、αE-catenin、MMP-9等相關分子的生物功能有關。4、Kiss-1基因高表達可顯著抑制BGC823胃癌細胞裸小鼠皮下移植瘤的生長,抑制血行播散的BGC823胃癌細胞在裸小鼠體內(nèi)肺、肝臟轉(zhuǎn)移瘤的形成,其機制除了與誘導G0/G1期阻滯和細胞早期凋亡、抑制ERK1/2、PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導通路活性、影響YAP1、αE-catenin、MMP-9等相關分子的生物功能有關外,還與kiss-1基因下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Sp1、抑制VEGF轉(zhuǎn)錄、進而抑制腫瘤血管生成有關。迄今,關于kiss-1可能通過下調(diào)YAP1進而抑制BGC823胃癌細胞血行播散臟器定植轉(zhuǎn)移的研究尚未見報道。
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Kiss-1 基因在人胃癌組織中的表達顯著低于正常胃粘膜用 qRT-PCR 方法檢測胃癌組織、配對正常胃粘膜組織中的 ki 水平，，由于 kiss-1 基因和內(nèi)參 GAPDH 的擴增效率不同，采用雙析。從溶解曲線可看出，kiss-1 基因的拷貝數(shù)不多，很難與 GAP擴增效率，提示正常胃粘膜組織 kiss-1 基因總體表達水平較低， 基因表達低于配對正常胃粘膜組織，差異有統(tǒng)計學意義，P=0.03圖 1. Kiss-1 低表達胃癌患者生存分析Figure 1. Survival analysis of kiss-1 low expression gastric cancer patients

3 Kiss-1 基因在人胃癌組織中的表達顯著低于正常胃粘膜采用 qRT-PCR 方法檢測胃癌組織、配對正常胃粘膜組織中的 kiss-1 基因NA 水平，由于 kiss-1 基因和內(nèi)參 GAPDH 的擴增效率不同，采用雙標曲線法分析。從溶解曲線可看出，kiss-1 基因的拷貝數(shù)不多，很難與 GAPDH 達到的擴增效率，提示正常胃粘膜組織 kiss-1 基因總體表達水平較低，胃癌組織s-1 基因表達低于配對正常胃粘膜組織，差異有統(tǒng)計學意義，P=0.038（圖 2，2）。圖 1. Kiss-1 低表達胃癌患者生存分析Figure 1. Survival analysis of kiss-1 low expression gastric cancer patients
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

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1 樊清波;劉紅山;秦秉玉;王存真;劉晗;鄭鵬遠;;Kiss1在胃腺癌組織中的表達及其對胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響[J];中華實驗外科雜志;2014年03期

2 楊國儀;周志毅;周婧;夏鈺弘;梁加貝;;肝癌組織中β-連環(huán)素和上皮性鈣黏附蛋白的表達及其意義[J];江蘇醫(yī)藥;2012年07期

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本文編號：2697793