發(fā)布時(shí)間：2020-06-02 14:24

【摘要】：紫杉醇是一種高效的抗癌藥物,目前主要從紅豆杉中提取,但由于紅豆杉資源匱乏導(dǎo)致其藥源緊缺。利用內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇是最有前景的替代途徑之一。然而,目前發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的紫杉醇產(chǎn)量較低,均不具備大規(guī)模生產(chǎn)的價(jià)值。通過對(duì)真菌紫杉醇代謝途徑的定向遺傳改造,超表達(dá)紫杉醇合成限速酶基因和調(diào)控基因是獲得紫杉醇高產(chǎn)基因工程菌株的主要途徑之一。但目前關(guān)于真菌紫杉醇的合成途徑及其相關(guān)基因知之甚少,因此克隆真菌紫杉醇合成相關(guān)基因并明晰其功能,是揭示真菌紫杉醇合成途徑以及利用基因工程技術(shù)提高真菌紫杉醇產(chǎn)量的關(guān)鍵。本文從產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌枝狀枝孢霉MD2中克隆候選基因A10182和A10251,并通過超表達(dá)技術(shù)分析這兩個(gè)候選基因?qū)χ钪︽呙筂D2紫杉醇及其他5種紫杉烷類合成的影響,為后期深入研究候選基因A10182和A10251的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。取得主要研究成果如下:(1)克隆了候選基因A10182和A10251的DNA全長序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。候選基因A10182和A10251長度分別為678 bp和906 bp,編碼產(chǎn)物分別與Endocarpon pusillum的假定蛋白(GenBank no.XP007808865.1)和Pseudocercospora muase的假定蛋白(GenBank no.KXT16021.1)同源性最高。A10182和A10251的編碼蛋白均為疏水性蛋白,不含有二次跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽。A10182的編碼蛋白共有225個(gè)氨基酸,分子量為24.984 kDa,共有4個(gè)α螺旋、10個(gè)延伸鏈。A10251的編碼蛋共有301個(gè)氨基酸,分子量為33.320 kDa,共有3個(gè)α螺旋、1個(gè)延伸鏈。(2)成功構(gòu)建了候選基因A10182的超表達(dá)載體pTFCM-A10182,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化枝狀枝孢霉MD2,并通過平板抗性篩選和抗性基因hph的擴(kuò)增檢測,共獲得23株A10182-轉(zhuǎn)基因菌株。隨機(jī)挑取13株轉(zhuǎn)基因菌株進(jìn)行Southern blot分析,結(jié)果表明:13株A10182-轉(zhuǎn)基因菌株的外源基因是以單拷貝方式與宿主染色體DNA整合;隨機(jī)選擇其中3株并采用qRT-PCR技術(shù)檢測候選基因的表達(dá)量,結(jié)果表明:與對(duì)照菌株(未轉(zhuǎn)基因)相比,3株轉(zhuǎn)基因菌株中候選基因的表達(dá)量均增加,其中轉(zhuǎn)基因菌株AC的A10182表達(dá)量最高,約是對(duì)照的2.0倍。HPLC檢測結(jié)果表明:與對(duì)照菌株的紫杉醇(5.033±0.132μg/g)、10-去乙酰巴卡亭III(15.062±0.304μg/g)、10-去乙酰紫杉醇(4.044±0.089μg/g)、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(2.387±0.059μg/g)產(chǎn)量相比,A10182-轉(zhuǎn)基因菌株AC的紫杉醇(5.187±0.016μg/g)、10-去乙酰巴卡亭III(20.411±0.335μg/g)、10-去乙酰紫杉醇(4.518±0.091μg/g)、7-木糖-10去乙酰紫杉醇(3.434±0.061μg/g)的產(chǎn)量均有所提高;并且A10182-轉(zhuǎn)基因菌株AC中檢測到多烯紫杉醇,產(chǎn)量約為2.709±0.106μg/g。該結(jié)果預(yù)示超表達(dá)候選基因A10182對(duì)枝狀枝孢霉MD2上述紫杉烷類的合成有促進(jìn)作用。(2)構(gòu)建候選基因A10251的超表達(dá)載體pTFCM-A10251并轉(zhuǎn)化枝狀枝孢霉MD2,共獲得30株A10251-轉(zhuǎn)基因菌株。隨機(jī)挑選14株轉(zhuǎn)基因菌株進(jìn)行Southern blot檢測,結(jié)果表明:4株A10251-轉(zhuǎn)基因菌株AC、AV、AH、AE中的外源基因是以單拷貝方式整合到宿主染色體DNA;qRT-PCR檢測結(jié)果表明:與對(duì)照菌株相比,A10251-轉(zhuǎn)基因菌株AC的候選基因表達(dá)量最高,約為對(duì)照的2.0倍。HPLC檢測結(jié)果表明:與對(duì)照菌株的紫杉醇(5.033±0.132μg/g)、10-去乙酰巴卡亭III(15.062±0.304μg/g)、10-去乙酰紫杉醇(4.044±0.089μg/g)、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(2.387±0.059μg/g)產(chǎn)量相比,A10251-轉(zhuǎn)基因菌株AC的紫杉醇(6.022±0.116μg/g)、10-去乙酰巴卡亭III(22.304±0.442μg/g)、10-去乙酰紫杉醇(4.209±0.097μg/g)、7-木糖-10去乙酰紫杉醇(3.378±0.074μg/g)的產(chǎn)量均有所提高;并且轉(zhuǎn)基因菌株AC中檢測到了多烯紫杉醇,產(chǎn)量約為1.983±0.094μg/g。該結(jié)果預(yù)示超表達(dá)候選基因A10251對(duì)枝狀枝孢霉MD2上述紫杉烷類的合成有促進(jìn)作用。
【圖文】：

、皂苷等[1,2]。紫杉醇（Paclitaxel，商有抗癌作用的異戊烯類次生代謝 853.92，系統(tǒng)名為 5β,20-環(huán)氧-1,2酯-2-苯甲酸酯-13-（2’R，3’S）-N- 與 Wall 同 Andre T. Mcphail 闡明其二萜組成的碳環(huán)基本骨架及一個(gè)苯分[4]。紫杉醇具有獨(dú)特的抗癌作用雙聚體的裝配而維持微管蛋白穩(wěn)定阻滯于 G2/M 期從而抑制癌細(xì)胞的批準(zhǔn)紫杉醇用于治療卵巢癌，，隨后發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)紫杉醇植物除紅豆杉，還

2.3.3 候選基因 A10182 和 A10251 的生物信息學(xué)分析采用 Blastp、ProtParam、ProtScale、TMHMM、SignalP 4.1、PsiPred 和 SMART 在線生物信息學(xué)軟件分別對(duì) A10251 和 A10182 編碼蛋白進(jìn)行分析。2.4 結(jié)果與分析2.4.1 候選基因 A10182 和 A10251 響應(yīng) MeJA 誘導(dǎo)的表達(dá)特征本研究在前期實(shí)驗(yàn)室采用 RNA-Seq 技術(shù)進(jìn)行的枝狀枝孢霉 MD2 響應(yīng) MeJA 誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)（0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h）的轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，選取響應(yīng)茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)表達(dá)量變化明顯（圖 2.1）的 UnigeneA10182 和 A10251 為本研究的候選基因。
【學(xué)位授予單位】：中南民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q93;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2693291