【摘要】：本文以紅核桃品種資源紅瓤核桃和普通綠核桃的葉片和果皮為材料,對葉片和果皮花青苷成分及含量進行了測定;通過比較轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了兩品種的葉片和果皮在不同發(fā)育階段與花青苷合成的差異表達酶基因與轉(zhuǎn)錄因子;并對其進行了驗證。主要研究結(jié)果如下:1.建立超高效液相色譜-二極管陣列檢測器串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-PDA-MS/MS)定性和定量檢測方法,對不同時期的紅瓤核桃和普通綠核桃的葉片及果皮提取物進行了初步分析。結(jié)果表明:從‘紅瓤核桃’葉片中檢測出飛燕草-3-O-半乳糖苷等8種花青苷,不同時期的葉片中花青苷類物質(zhì)組分和含量差異顯著。在紅瓤核桃果皮中僅僅檢測到飛燕草素-3-O-葡萄糖苷。在普通綠核桃的葉片和果皮中,均未檢測到花青苷的存在。2.利用Illumina Hiseq 2500測序平臺對紅瓤核桃和普通綠核桃葉片、果皮分別進行轉(zhuǎn)錄組測序。在葉片中測序獲得544,888,472raw reads,基因注釋發(fā)現(xiàn),共計30,648條genes(95.98%)得到了功能注釋,其中共有19,520條genes映射到GO不同的節(jié)點。有17,701條genes被歸類到26個COG功能類別中,通過KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn),7,477條genes參與了242個生物學(xué)途徑。在果皮中,測序獲得423,238,369 raw reads,基因功能注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn),共計29,370條genes(96.47%)得到了功能注釋,其中共有19,080條genes映射到GO不同的節(jié)點。有17,389條genes被歸類到26個COG功能類別中,通過KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn),7,369條genes參與了242個生物學(xué)途徑。3.利用表達譜對紅瓤核桃花青苷生物合成途徑相關(guān)基因的表達進行分析,結(jié)果表明,在紅瓤核桃與普通綠核桃葉片發(fā)育過程中,紅瓤核桃PAL、4CL、F3H、F3’5’H、DFR、ANS和UFGT基因較綠核桃葉片呈上調(diào)表達模式。與此同時,紅瓤核桃與普通綠核桃果皮中,紅瓤核桃4CL、CHS、F3H、F3’5’H、DFR、ANS和UFGT基因的表達量較綠核桃呈上調(diào)表達模式,葉片中編碼CHS基因的Jrgene4994和果皮中編碼PAL基因的Jrgene11958在綠核桃的轉(zhuǎn)錄水平的含量明顯高于紅瓤核桃,這與其他基因的轉(zhuǎn)錄水平模式相反。此外,在葉片中篩選出3個MYB、2個bHLH和2個WD40轉(zhuǎn)錄因子,在果皮中篩選出3個MYB、2個bHLH和3個WD40轉(zhuǎn)錄因子可能與花青苷的生物合成相關(guān)。采用qRT-PCR對葉片中15個酶基因與轉(zhuǎn)錄因子和果皮中15個酶基因和轉(zhuǎn)錄因子進行了表達驗證,結(jié)果表明qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)結(jié)果基本一致。
【圖文】：

圖 1 花青苷典型結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic diagram of the structural of anthocyanins1.3 花青苷的提取、純化和定性定量分析1.3.1 花青苷的提取、純化植物體中的花青苷往往是最安全，成分最為豐富的，花青苷的獲取一般是來自于植物體，化學(xué)合成和生物合成也是另外的一種途徑。從植物中提取花青苷的常用方法有溶劑提取法、萃取法、超聲波輔助提取法和酶解法等方式[18,19]。由于花青苷的結(jié)構(gòu)特性，其在強酸條件下（pH＜3）的結(jié)構(gòu)狀態(tài)最為穩(wěn)定。隨著溶液的 pH 值增加，花青苷的結(jié)構(gòu)就會發(fā)生轉(zhuǎn)化，形成不穩(wěn)定的甲醇假堿（carbinol base）。因此，在提取花青苷的過程中，應(yīng)保持溶液的 pH 值一直處在酸性的條件下，從而能夠預(yù)防花青素的降解。實驗?zāi)康牡牟煌�，用來提取花青苷的方式也不同，最常用的方法是溶劑提取法，溶劑一般為甲醇、乙醇、丙酮、水或其混合溶劑。提取過程中為了防止花青苷的降解，常加入一定濃度的酸性溶液，增強溶液酸性環(huán)境。提取溶劑一般為 0.1%鹽酸/甲醇體系，適用于多種植物中的花青苷的提取[20,21]。后來有采用 0.1%鹽酸/5%甲酸溶液代替甲醇以避免有害物質(zhì)甲醇的殘留[22]。但是一般多用檸檬酸、酒石酸等

CHS) 、 查 爾 酮 異 構(gòu) 酶 (chalcone isomerase ， CHI) 和 黃 烷 酮 3- 羥 化 酶(flavanone3-hydroxylase，F(xiàn)3H)，因 CHS，CHI 是花青苷的啟動關(guān)鍵酶，固這一階段是類黃酮代謝的關(guān)鍵反應(yīng)，能為花青苷及其它類黃酮類提供前體物質(zhì);第三階段參與的酶有二氫黃酮醇還原酶(dihydroflavonol4-reductase，DFR)、類黃酮 3’-羥化酶(flavonoid3’-hydroxylase，F(xiàn)3’H)、類黃酮 3’,5’-羥化酶(flavonoid3’,5’-hydroxylase，F(xiàn)3’5’H)、花青素合成酶(anthocyanidinsynthase，ANS)和類黃酮 3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(flavonoid3-O-glucosyltransferase，3GT)，二氫黃酮醇經(jīng)過 F3’H 或者 F3’5’H 的催化，會形成相對應(yīng)的不同的花青苷前體物質(zhì)，，花青苷類物質(zhì)的合成途徑的分化也就在這個階段進行分別的合成。在這些酶中 CHS、CHI、F3H 和 F3’H或 F3’5’H 存在于所有黃酮類化合物的合成中，前體物質(zhì)在這些酶分別的催化下形成對應(yīng)的相同的物質(zhì)，這些酶基因是花青苷生物合成的早期結(jié)構(gòu)基因。而自 DFR 到 UFGT 編碼的酶催化同一物質(zhì)卻形成了不同的花青苷，稱為花青苷特有酶，這些酶基因是花青苷生物合成的晚期結(jié)構(gòu)基因[29]。
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S664.1

【參考文獻】

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本文編號：2692466