【摘要】：番紅花是鳶尾科番紅花屬球莖類草本植物,具有良好的活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效,現(xiàn)代多用于治療心腦血管疾病和抑郁癥。其特有的以藏紅花苦素、藏花醛、西紅花酸及其糖苷衍生物西紅花總苷為代表的類胡蘿卜素類化合物是發(fā)揮藥效的主要成分。番紅花柱頭是西紅花苷等成分合成和積累的場所,柱頭作為藥用部位其生物量較小而導致產(chǎn)量稀少。整合分析多重組學數(shù)據(jù),發(fā)掘西紅花柱頭發(fā)育或糖苷合成相關基因,利用分子生物學手段,開展番紅花有效成分生源途徑解析,并驗證影響柱頭發(fā)育基因的生物學功能。在此基礎上,培育高產(chǎn)優(yōu)質番紅花品系,能有效緩解西紅花市場的供需矛盾。為了發(fā)現(xiàn)潛在的關鍵酶基因及分子調(diào)控基礎,本課題針對不同發(fā)育時期的番紅花柱頭同步進行了轉錄組和代謝組分析,特別監(jiān)控與西紅花苷合成途徑相關的代謝流。從轉錄組中共組裝得到269,943條Unigenes,根據(jù)差異基因的表達趨勢可將所有的差異基因分為7種表達模式,共注釋出181條可能參與西紅花苷合成的酶基因,篩選出63個可能調(diào)控西紅花苷合成的轉錄因子。而代謝組分析指認出15個西紅花苷合成途徑中的化合物,其含量變化趨勢可分為4種模式。為了深入挖掘基因和化合物間的相關性,本研究整合兩個組學數(shù)據(jù),構建了“轉錄因子-基因-化合物”共表達網(wǎng)絡,切實將候選基因的范圍縮小到32條酶基因及28條編碼轉錄因子的轉錄本。更重要的是,共表達網(wǎng)絡篩分別篩選到7、4和4條目前在西紅花苷合成途徑中未被具體研究的關鍵酶基因β-GS、ADH和UGT。釀酒酵母的代謝工程研究顯示篩選的CsADH酶可催化合成西紅花酸,亦證實共表達網(wǎng)絡篩選目標基因方法的可靠性。綜合“基因-化合物”共表達網(wǎng)絡分析及熒光定量PCR結果,指認AGL6b基因的表達與西紅花酸隨柱頭發(fā)育的含量變化正相關。而AGL6基因屬于MADS-box調(diào)控因子家族,該家族在多種模式植物中都表現(xiàn)出調(diào)控花發(fā)育的功能,由此推測:番紅花AGL6b基因與西紅花苷合成途徑中的次生代謝產(chǎn)物積累有密切聯(lián)系,可能是通過調(diào)控番紅花花器官的發(fā)育,引起柱頭生物量的改變而導致次生代謝物含量變化。因而對來自西紅花轉錄組數(shù)據(jù)庫中的17條MADS-box轉錄因子進行了系統(tǒng)的生物信息學分析,解讀核苷酸序列,及對其編碼的氨基酸序列的組成成分、理化性質、信號肽、導肽、跨膜結構域、亞細胞定位、親疏水性、蛋白質的二級、三級結構及功能域進行預測分析,并將番紅花和其他植物的MADS-box蛋白進行同源比對,同時構建了番紅花和模式植物擬南芥MADS-box蛋白家族的系統(tǒng)進化樹,其結果為今后進一步深入研究番紅花MADS-box蛋白的生物學功能提供可靠的參考依據(jù)。整合共表達網(wǎng)絡及番紅花轉錄組,獲得5條在番紅花柱頭中特異性高表達的MADS-box基因,命名為SCR(Stigma and Crocins Regulator)。為了驗證此類基因對于番紅花柱頭發(fā)育或糖苷合成的調(diào)控作用,對所得序列進行克隆和分析,初步開展亞細胞定位及擬南芥過表達的實驗。CsSCR基因編碼的氨基酸分子量在25.0 kDa左右,等電點在9.15左右,均為堿性蛋白。同時結構域分析發(fā)現(xiàn)5個蛋白都含有60個氨基酸組成的MADS結構域,以及其后都接有93個氨基酸大小的K-BOX結構域,證明5條蛋白都屬于MADS轉錄因子家族。亞細胞定位實驗結果證實5條番紅花SCR蛋白的轉錄因子特性,其定位于細胞核中發(fā)揮轉錄調(diào)控作用;而擬南芥過表達實驗發(fā)現(xiàn),CsSCR3和CsSCR5可調(diào)控擬南芥花發(fā)育,導致早花現(xiàn)象出現(xiàn)。綜上所述,本研究整合多重組學數(shù)據(jù),報道了多個參與西紅花苷合成途徑的候選基因,為后續(xù)開展番紅花有效成分生源途徑解析奠定了基礎,并提供了一個從柱頭發(fā)育角度提高西紅花苷含量的新型代謝工程研究視角。在此基礎上培育高產(chǎn)優(yōu)質番紅花品系,切實提升番紅花這一重要藥用資源的品質,為做強做大番紅花產(chǎn)業(yè)提供堅實的上游支撐。
【圖文】：

組數(shù)據(jù)庫的構建驗材料和設備料紅花柱頭由上海華宇藥業(yè)有限公司西紅花 GAP 種植醫(yī)大學藥學院生藥教研室張漢明教授鑒定為鳶尾的柱頭。根據(jù)前人[33]對不同發(fā)育時期的番紅花柱頭分D 時期柱頭，細長花管中閉合花苞里約 0.8cm 長的紅兩天，細長花管中閉合花苞里約 3cm 長的暗紅色柱頭，細長花管頂生的張開花苞里約 3cm 長的暗紅色柱天，盛開花苞里約 3cm 長的暗紅色柱頭。每個番紅花同一球莖上 4 朵花的柱頭為一個生物學重復，取 3 個后保存于-80℃超低溫冰箱。

- 16 -圖 1-2 qRT-PCR 程序設定圖數(shù)據(jù)處理：利用 2-ΔΔCt進行相對定量，，根據(jù) Ct 法計算不同樣本中目的基因的表達水平。將 ΔCt 值最小的一組設為對照組，即基因表達量最高的樣品設為 1，使用相對定量公式進行計算：目的基因的相對表達量即 2-ΔΔCt；ΔΔCt=(Ct 目的基因-Ct 內(nèi)參基因)樣品-(Ct 目的基因-Ct 內(nèi)參基因)對照；2-ΔΔCt表示與對照組相比，樣品組中目的基因表達量的變化倍數(shù)。（三）實驗結果與分析1. 測序結果與質量評估本實驗使用IlluminaHiSeq2500平臺分別對三個發(fā)育時期（RED，-2DAY，0DAY）番紅花柱頭樣品（每個時期三個重復）進行轉錄組測序，構建了 9 個 cDNA 文庫。其中去除接頭和低質量序列后，RED， -2DAY，0DAY 時期分別得到平均長度為 123.64,
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S567.239

【參考文獻】

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本文編號：2691927