【摘要】：寡孢節(jié)叢孢(Arthrobotrys oligospora)是捕食線蟲(chóng)真菌的代表菌株。其無(wú)性繁殖方式主要通過(guò)產(chǎn)生分生孢子,目前人們對(duì)其無(wú)性產(chǎn)孢機(jī)制及相關(guān)產(chǎn)孢基因的研究甚少。本論文以該真菌為實(shí)驗(yàn)菌株,以3個(gè)調(diào)控分生孢子形成的相關(guān)基因VosA(AOL_s00054g700)、VelB(AOL_s00054g811)和Acy(AOL_s00080g284)為研究對(duì)象,利用基因敲除和Real time PCR等分子生物學(xué)技術(shù),初步探究了VosA、VelB和Acy蛋白在寡孢節(jié)叢孢生長(zhǎng)發(fā)育、捕食器官形成和產(chǎn)孢等過(guò)程中的功能。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.VosA、VelB和Acy蛋白的氨基酸序列和聚類分析對(duì)寡孢節(jié)叢孢3個(gè)產(chǎn)孢相關(guān)蛋白VosA、VelB和Acy的氨基酸序列和功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,Acy蛋白的分子量較大,含有2100個(gè)氨基酸,VosA蛋白和VelB蛋白的分子量相對(duì)較小分別含有497個(gè)和335個(gè)氨基酸,VosA和VelB屬于velvet家族蛋白,它們都含有2個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域:Velvet factor結(jié)構(gòu)域(IPR021740)和Velvet結(jié)構(gòu)域(IPR037525)。Acy蛋白的保守結(jié)構(gòu)域較多,含有Adenylyl cyclase class-3/4/guanylyl cyclase(IPR001054)和Leucine-rich repeat(IPR001611)等8個(gè)結(jié)構(gòu)域。聚類分析表明,VosA、VelB和Acy分別與構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)的同源蛋白的親緣關(guān)系較近。2.VosA、VelB和Acy基因的敲除及表型研究利用同源重組的方法,成功獲得了VosA、VelB和Acy的敲除突變菌株,并對(duì)它們的表型特征進(jìn)行了比較,包括菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速率、孢子數(shù)量及形態(tài)、捕器的形成和數(shù)量以及胞外蛋白酶的活性等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ΔAcy突變株的生長(zhǎng)速率比野生型菌株慢且氣生菌絲較弱,菌絲形態(tài)發(fā)生改變,不能產(chǎn)生孢子和三維菌網(wǎng),胞外蛋白酶活性顯著下降;ΔVelB突變株生長(zhǎng)速率明顯比野生型慢且菌落變得稠密,氣生菌絲明顯減少,菌絲形態(tài)發(fā)生改變,不能產(chǎn)生孢子,三個(gè)轉(zhuǎn)化子中有一個(gè)產(chǎn)生捕器但捕器數(shù)量減少,胞外蛋白酶活性下降;而ΔVosA突變株與野生型相比表型無(wú)明顯變化。3.寡孢節(jié)叢孢野生菌株、ΔVelB和ΔAcy突變菌株中部分表型相關(guān)基因的定量分析收取分別培養(yǎng)3、5和7天的ΔVelB和ΔAcy突變株和野生型菌株樣品,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。選取與產(chǎn)孢、抗逆性以及胞外蛋白酶等表型差異相關(guān)的部分基因進(jìn)行RT-PCR分析,在ΔVelB突變株中,產(chǎn)孢、抗逆性和胞外蛋白酶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)野生型菌株有較大的變化,且大部分都是降低的,與VelB突變株的表型相符。在ΔAcy突變株中,產(chǎn)孢、抗逆性和胞外蛋白酶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)野生型菌株有較大的變化,大部分在第3和5天下降,在第7天恢復(fù)到野生型的轉(zhuǎn)錄水平。說(shuō)明VelB和Acy蛋白參與寡孢節(jié)叢孢的產(chǎn)孢、抗逆性和致病性等生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。本論文的創(chuàng)新性:1.敲除了寡孢節(jié)叢孢中三個(gè)產(chǎn)孢調(diào)控相關(guān)蛋白(VosA、VelB和Acy)的編碼基因,對(duì)野生菌株和敲除突變株的生物學(xué)表型進(jìn)行了較系統(tǒng)的比較,發(fā)現(xiàn)VelB和Acy蛋白參與寡孢節(jié)叢孢的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、抗逆性和致病性等生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。2.利用熒光定量PCR,比較ΔVelB和ΔAcy突變株和野生菌株在產(chǎn)孢、細(xì)胞壁合成、抗氧化和胞外蛋白酶等差異表型相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,對(duì)VelB和Acy參與寡孢節(jié)叢孢產(chǎn)孢、抗逆性以及胞外蛋白酶生產(chǎn)的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步的分析。
【圖文】：

構(gòu)巢曲霉產(chǎn)孢示意圖

構(gòu)巢曲霉產(chǎn)孢的遺傳調(diào)控模式圖
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q933

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2689823