【摘要】：第一部分荷載SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒對(duì)前列腺癌的靶向治療作用目的:觀察荷載SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒(ZD55-SATB1)體內(nèi)外對(duì)前列腺癌的靶向治療作用。方法:結(jié)晶紫染色、CCK8法觀察ZD55-SATB1對(duì)前列腺癌細(xì)胞的毒性作用和增殖抑制效果。RT-PCR評(píng)價(jià)ZD55-SATB1對(duì)前列腺癌細(xì)胞SATB1基因的m RNA表達(dá)的沉默作用;Western Blot檢測(cè)ZD55-SATB1對(duì)前列腺癌細(xì)胞SATB1蛋白及E1A表達(dá)的影響;Transwell研究ZD55-SATB1對(duì)前列腺癌細(xì)胞侵襲的影響;構(gòu)建荷載前列腺癌DU145細(xì)胞的裸鼠皮下移植瘤模型。隨機(jī)分成4組,每組6只,分別用ZD55-SATB1、ZD55-EGFP、Ad-SATB1、PBS瘤內(nèi)注射治療,100μl病毒(5×108 pfu),隔天一次,共三次。每周測(cè)量腫瘤體積,繪制腫瘤時(shí)間-體積生長(zhǎng)曲線。第49天,全部處死裸鼠,免疫組化檢測(cè)各組SATB1表達(dá)水平;TUNEL評(píng)價(jià)腫瘤組織細(xì)胞的凋亡情況。取肝、肺臟組織HE染色觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果1.結(jié)晶紫染色結(jié)果:病毒ZD55-SATB1、ZD55-EGFP、Ad-SATB1對(duì)前列腺癌細(xì)胞均有殺傷作用,且隨著病毒濃度的增大毒性作用逐漸增強(qiáng),其中ZD55-SATB1的殺傷作用最強(qiáng);ZD55-SATB1的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)比ZD55-EGFP、Ad-SATB1顯著,而在正常細(xì)胞PZ-HPV-7中,在100MOI時(shí)ZD55-SATB1才出現(xiàn)CPE,提示ZD55-SATB1介導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有腫瘤靶向性。2.CCK-8結(jié)果:隨著病毒感染時(shí)間延長(zhǎng),前列腺癌細(xì)胞的存活率均逐漸下降。ZD55-SATB1對(duì)前列腺癌細(xì)胞殺傷作用,強(qiáng)于ZD55-EGFP、Ad-SATB1;感染96h后,ZD55-SATB1組DU145、LNCa P細(xì)胞存活率分別為(31.6±3.31%,36.6±3.63%),ZD55-EGFP組為(61.7±2.42%,65.4±2.324%),Ad-SATB1組為(82.4±3.54%,86.4±4.18%),ZD55-SATB1細(xì)胞存活率明顯降低,與其他兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而正常細(xì)胞PZ-HPV-7細(xì)胞感染病毒后,存活率卻未出現(xiàn)明顯變化。3.RT-PCR結(jié)果:ZD55-SATB1和Ad-SATB1均能特異沉默DU145、LNCa P細(xì)胞SATB1基因,分別為(36.5±3.1%、43.1±4.2%)和(51.9±3.2%、64.3±4.1%),與ZD55-EGFP和PBS對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),表明ZD55-SATB1特異性沉默SATB1基因的表達(dá),且比Ad-SATB1沉默效果進(jìn)一步提高。4.Western Blot結(jié)果顯示:ZD55-SATB1和Ad-SATB1組DU145細(xì)胞中SATB1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為PBS組的(40.1±3.7%,61.9±3.4%),LNCa P細(xì)胞中兩組分別為對(duì)照組的(45.9±3.2%,67.1±3.7%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而ZD55-EGFP對(duì)SATB1蛋白表達(dá)水平基本無影響,證實(shí)ZD55-SATB1可以有效地沉默前列腺癌細(xì)胞中SATB1基因蛋白的表達(dá)。ZD55-SATB1、ZD55-EGFP組E1A蛋白表達(dá)水平在前列腺癌細(xì)胞DU145和LNCa P中顯著高于Ad-SATB1,表明ZD55-SATB1、ZD55-EGFP可在前列腺癌細(xì)胞中高效復(fù)制。另外,ZD55-SATB1、ZD55-EGFP在人正常前列腺上皮細(xì)胞PZ-HPV-7幾乎不表達(dá)E1A,進(jìn)一步說明ZD55-SATB1具有腫瘤靶向性。5.Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果:ZD55-SATB1組DU145和LNCa P穿過的細(xì)胞數(shù)分別為(61.3±17.25和25.4±6.2),明顯少于Ad-SATB1組(170.1±25.44和42.7±10.7)及ZD55-EGFP組(295.4±23.36和77.6±15.2),各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表明ZD55-SATB1可有效抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲。6.移植瘤:ZD55-SATB1組腫瘤平均體積為(295.3±51.9)mm3,比ZD55-EGFP組(525.6±89.3)mm3、Ad-SATB1組(582.3±97.0)mm3和PBS組(777.1±139.8)mm3顯著減小,ZD55-SATB1組與各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示ZD55-SATB1對(duì)前列腺移植瘤的生長(zhǎng)抑制效果比ZD55-EGFP、Ad-SATB1組明顯增強(qiáng)。7.肺組織HE染色結(jié)果顯示:PBS組有8只裸鼠出現(xiàn)腫瘤肺轉(zhuǎn)移,同時(shí)ZD55-EGFP組有2只出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,而ZD55-SATB1和Ad-SATB1組則沒有出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,提示ZD55-SATB1可抑制前列腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。8.TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果:ZD55-SATB1組凋亡陽性細(xì)胞率為(87.3±4.8)%,ZD55-EGFP組為(51.2±3.4)%,Ad-SATB1組為(41.3±3.2)%,PBS組為(20.1±1.9)%,ZD55-SATB1組凋亡率顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明ZD55-SATB1可促進(jìn)移植瘤細(xì)胞的凋亡。結(jié)論:成功構(gòu)建了新型溶瘤腺病毒ZD55-SATB1,通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZD55-SATB1可以在前列腺癌細(xì)胞中特異性增殖,干擾SATB1基因的表達(dá);ZD55-SATB1在體外對(duì)前列腺癌細(xì)胞具有較好殺傷、增殖抑制作用及抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲作用;ZD55-SATB1可以有效抑制人前列腺癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、促進(jìn)其凋亡,為前列腺癌的生物與基因治療奠定了基礎(chǔ)。第二部分荷載SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒聯(lián)合內(nèi)分泌、化療治療激素敏感性前列腺癌目的:觀察荷載SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒(ZD55-SATB1)聯(lián)合內(nèi)分泌、化療對(duì)激素敏感性前列腺癌的治療作用。方法:1.CCK8法觀察對(duì)激素敏感性前列腺癌LNCa P細(xì)胞的毒性作用和增殖抑制效果。2.Hoechst-33258染色、TUNEL檢測(cè)前列腺癌LNCa P細(xì)胞凋亡情況。3.Migration檢測(cè)前列腺癌LNCa P細(xì)胞的遷移。4.Invasion檢測(cè)前列腺癌LNCa P細(xì)胞的侵襲。5.Western blot檢測(cè)SATB1及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2,caspase-3和caspase-8的表達(dá)。6.構(gòu)建裸鼠前列腺癌LNCa P細(xì)胞皮下移植瘤模型,隨機(jī)分成8組:空白對(duì)照組(PBS組)、內(nèi)分泌治療組(ET組:手術(shù)去勢(shì))、藥物治療組(DTX組)、病毒治療組(ZD55-SATB1組)、內(nèi)分泌治療聯(lián)合化療組(ET+DTX組)、病毒聯(lián)合內(nèi)分泌治療組(ZD55-SATB1+ET組)、病毒聯(lián)合化療組(ZD55-SATB1+DTX組)、病毒聯(lián)合化療及內(nèi)分泌治療組(ET+DTX+ZD55-SATB1組)。7.測(cè)量腫瘤體積,繪制腫瘤時(shí)間-體積生長(zhǎng)曲線。8.HE染色觀察腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。9.免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中caspase-3、caspase-8、Bcl-2和CD31蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.CCK-8結(jié)果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1聯(lián)合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS分別作用LNCa P細(xì)胞,48h后的存活率分別為(37.61±2.17)%、(65.32±5.06)%、(72.25±3.40)%、(55.94±3.97)%、(89.67±4.62)%、(81.17±2.19)%。ZD55-SATB1聯(lián)合DTX組分別與單用ZD55-SATB1組、ZD55-EGFP組、DTX組、Sitelong組和PBS組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。ZD55-SATB1聯(lián)合DTX組與Sitelong組比較,對(duì)LNCa P細(xì)胞增殖的抑制作用更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明ZD55-SATB1聯(lián)合DTX及去除十一酸睪酮的聯(lián)合,對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用較僅病毒聯(lián)合化療進(jìn)一步增強(qiáng)。2.Hoechst33258結(jié)果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1聯(lián)合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS組凋亡率(%)分別為:64.00±6.52、52.67±8.14、33.33±3.59、36.52±7.84、5.71±2.26和6.01±4.64,聯(lián)合組與單一治療組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),說明聯(lián)合治療具有較強(qiáng)的促凋亡作用。3.Migration實(shí)驗(yàn)結(jié)果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1聯(lián)合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS分別作用LNCa P細(xì)胞,培養(yǎng)24h后,穿膜細(xì)胞數(shù)分別為27.23±7.14、35.10±2.38、40.31±2.59、68.46±3.58、118.01±5.64和106.24±10.35,聯(lián)合組與單一治療組比較,遷移細(xì)胞明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(P0.01)。4.Invasion實(shí)驗(yàn)結(jié)果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1聯(lián)合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS分別作用LNCa P細(xì)胞,培養(yǎng)24h后計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)分別為12.31±0.41、21.93±2.11、26.12±2.13、25.06±1.89、76.82±4.31和68.62±4.22,聯(lián)合組與其它各組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義(P0.01)5.TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1聯(lián)合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS處理48h后,各組的凋亡率分別為(31.13±6.88)%、(14.70±3.84)%、(12.29±5.26)%、(13.802±4.74)%、(4.36±2.23)%、(9.48±3.19)%。聯(lián)合組多于單一治療組,與PBS組相比,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果:5.0MOI的ZD55-SATB1聯(lián)合1.0ng/m L的DTX、10.0MOI的ZD55-SATB1、10.0 MOI的ZD55-EGFP、2.0ng/m L的DTX、100.0 ng/m L的Sitelong組、PBS組SATB1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為5.35±1.49、12.73±7.80、29.02±3.54、45.37±3.76、80.03±4.02、和91.72±4.45,聯(lián)合組SATB1蛋白的表達(dá)量較其它各組明顯減低(P0.05),說明腺病毒ZD55-SATB1聯(lián)合DTX可明顯抑制SATB1蛋白的表達(dá)且DTX不影響ZD55-SATB1的沉默效果。ZD55-SATB1組與其它單一治療組比較,SATB1蛋白的表達(dá)量差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),表明ZD55-SATB1可有效沉默SATB1基因,抑制SATB1蛋白的表達(dá)。各治療組Bcl-2的表達(dá)量顯著降低,caspase-3和caspase-8的表達(dá)量均增多,與單藥物治療組相比,聯(lián)合組對(duì)凋亡蛋白的影響更為顯著(P0.05),7.移植瘤體積:病毒聯(lián)合化療及內(nèi)分泌治療組、病毒聯(lián)合化療組、內(nèi)分泌治療聯(lián)合化療組、病毒聯(lián)合內(nèi)分泌治療組、病毒治療組、化療組、內(nèi)分泌治療組和空白對(duì)照組移植瘤終體積分別為264.92±28.88、555.64±254.89、555.64±254.89、1589.47±300.91、787.52±221.15、1127.25±271.93、1679.58±258.82、2287.41±254.89和2602.13±325.74。病毒聯(lián)合化療及內(nèi)分泌治療組療效最強(qiáng),顯著小于空白對(duì)照組以及單藥治療組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8.HE染色:內(nèi)分泌治療組、化療組、病毒治療組、病毒聯(lián)合內(nèi)分泌治療組、內(nèi)分泌治療聯(lián)合化療組、病毒聯(lián)合化療組、病毒聯(lián)合化療及內(nèi)分泌治療組的腫瘤組織中均可見較多的死細(xì)胞,細(xì)胞裂解成碎片,細(xì)胞核固縮碎裂,其正常的組織結(jié)構(gòu)消失,但聯(lián)合組的腫瘤細(xì)胞壞死更明顯。9.免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中caspase-3、caspase-8、Bcl-2和CD31蛋白的表達(dá):聯(lián)合組與單用藥物或病毒組相比,caspase-3、caspase-8蛋白表達(dá)量增多,Bcl-2蛋白表達(dá)量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。另一方面,與單用藥物或病毒組相比,聯(lián)合組移植瘤組織中CD31蛋白的表達(dá)量顯著降低,說明聯(lián)合組能夠有效促進(jìn)促凋亡蛋白的表達(dá),降低抑凋亡蛋白的表達(dá),且能在一定程度上抑制腫瘤組織血管的生成。結(jié)論:1.體外實(shí)驗(yàn)表明:溶瘤腺病毒和多西他賽對(duì)前列腺癌LNCa P細(xì)胞均有殺傷作用,體外給予Sitelong可促進(jìn)LNCa P細(xì)胞的增殖。同時(shí),溶瘤腺病毒聯(lián)合多西他賽及去雄激素治療可協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤效果。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明:溶瘤腺病毒、多西他賽和手術(shù)去勢(shì)均抑制前列腺癌LNCa P細(xì)胞皮下移植瘤的生長(zhǎng),且聯(lián)合效果優(yōu)于單一用藥,其可能的機(jī)制包括抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡、抑制血管生成。
【圖文】：

荷載 SATB1 基因 shRNA 的溶瘤腺病毒靶向治療前 表達(dá)最低，侵襲力亦最弱，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，有效沉默 SATB1 基因 細(xì)胞株的侵襲力顯著降低；同時(shí)，高效表達(dá) SATB1 基因后，LNCaP 細(xì)著增強(qiáng)，，進(jìn)一步證實(shí) SATB1 基因在前列腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重能是前列腺癌治療的理想靶點(diǎn)，以上研究發(fā)表在 J Transl Med. (2013 ,IF 3.99)[18-19]。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2683210