發(fā)布時間：2020-05-27 07:54

【摘要】：第一部分荷載SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒對前列腺癌的靶向治療作用目的:觀察荷載SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒(ZD55-SATB1)體內(nèi)外對前列腺癌的靶向治療作用。方法:結(jié)晶紫染色、CCK8法觀察ZD55-SATB1對前列腺癌細胞的毒性作用和增殖抑制效果。RT-PCR評價ZD55-SATB1對前列腺癌細胞SATB1基因的m RNA表達的沉默作用;Western Blot檢測ZD55-SATB1對前列腺癌細胞SATB1蛋白及E1A表達的影響;Transwell研究ZD55-SATB1對前列腺癌細胞侵襲的影響;構(gòu)建荷載前列腺癌DU145細胞的裸鼠皮下移植瘤模型。隨機分成4組,每組6只,分別用ZD55-SATB1、ZD55-EGFP、Ad-SATB1、PBS瘤內(nèi)注射治療,100μl病毒(5×108 pfu),隔天一次,共三次。每周測量腫瘤體積,繪制腫瘤時間-體積生長曲線。第49天,全部處死裸鼠,免疫組化檢測各組SATB1表達水平;TUNEL評價腫瘤組織細胞的凋亡情況。取肝、肺臟組織HE染色觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果1.結(jié)晶紫染色結(jié)果:病毒ZD55-SATB1、ZD55-EGFP、Ad-SATB1對前列腺癌細胞均有殺傷作用,且隨著病毒濃度的增大毒性作用逐漸增強,其中ZD55-SATB1的殺傷作用最強;ZD55-SATB1的細胞病變效應(yīng)(CPE)比ZD55-EGFP、Ad-SATB1顯著,而在正常細胞PZ-HPV-7中,在100MOI時ZD55-SATB1才出現(xiàn)CPE,提示ZD55-SATB1介導(dǎo)的細胞毒性具有腫瘤靶向性。2.CCK-8結(jié)果:隨著病毒感染時間延長,前列腺癌細胞的存活率均逐漸下降。ZD55-SATB1對前列腺癌細胞殺傷作用,強于ZD55-EGFP、Ad-SATB1;感染96h后,ZD55-SATB1組DU145、LNCa P細胞存活率分別為(31.6±3.31%,36.6±3.63%),ZD55-EGFP組為(61.7±2.42%,65.4±2.324%),Ad-SATB1組為(82.4±3.54%,86.4±4.18%),ZD55-SATB1細胞存活率明顯降低,與其他兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而正常細胞PZ-HPV-7細胞感染病毒后,存活率卻未出現(xiàn)明顯變化。3.RT-PCR結(jié)果:ZD55-SATB1和Ad-SATB1均能特異沉默DU145、LNCa P細胞SATB1基因,分別為(36.5±3.1%、43.1±4.2%)和(51.9±3.2%、64.3±4.1%),與ZD55-EGFP和PBS對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),表明ZD55-SATB1特異性沉默SATB1基因的表達,且比Ad-SATB1沉默效果進一步提高。4.Western Blot結(jié)果顯示:ZD55-SATB1和Ad-SATB1組DU145細胞中SATB1蛋白相對表達量分別為PBS組的(40.1±3.7%,61.9±3.4%),LNCa P細胞中兩組分別為對照組的(45.9±3.2%,67.1±3.7%),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而ZD55-EGFP對SATB1蛋白表達水平基本無影響,證實ZD55-SATB1可以有效地沉默前列腺癌細胞中SATB1基因蛋白的表達。ZD55-SATB1、ZD55-EGFP組E1A蛋白表達水平在前列腺癌細胞DU145和LNCa P中顯著高于Ad-SATB1,表明ZD55-SATB1、ZD55-EGFP可在前列腺癌細胞中高效復(fù)制。另外,ZD55-SATB1、ZD55-EGFP在人正常前列腺上皮細胞PZ-HPV-7幾乎不表達E1A,進一步說明ZD55-SATB1具有腫瘤靶向性。5.Transwell細胞侵襲實驗結(jié)果:ZD55-SATB1組DU145和LNCa P穿過的細胞數(shù)分別為(61.3±17.25和25.4±6.2),明顯少于Ad-SATB1組(170.1±25.44和42.7±10.7)及ZD55-EGFP組(295.4±23.36和77.6±15.2),各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),表明ZD55-SATB1可有效抑制前列腺癌細胞的侵襲。6.移植瘤:ZD55-SATB1組腫瘤平均體積為(295.3±51.9)mm3,比ZD55-EGFP組(525.6±89.3)mm3、Ad-SATB1組(582.3±97.0)mm3和PBS組(777.1±139.8)mm3顯著減小,ZD55-SATB1組與各組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),提示ZD55-SATB1對前列腺移植瘤的生長抑制效果比ZD55-EGFP、Ad-SATB1組明顯增強。7.肺組織HE染色結(jié)果顯示:PBS組有8只裸鼠出現(xiàn)腫瘤肺轉(zhuǎn)移,同時ZD55-EGFP組有2只出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,而ZD55-SATB1和Ad-SATB1組則沒有出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,提示ZD55-SATB1可抑制前列腺癌的遠處轉(zhuǎn)移。8.TUNEL實驗結(jié)果:ZD55-SATB1組凋亡陽性細胞率為(87.3±4.8)%,ZD55-EGFP組為(51.2±3.4)%,Ad-SATB1組為(41.3±3.2)%,PBS組為(20.1±1.9)%,ZD55-SATB1組凋亡率顯著增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),說明ZD55-SATB1可促進移植瘤細胞的凋亡。結(jié)論:成功構(gòu)建了新型溶瘤腺病毒ZD55-SATB1,通過體外實驗證實ZD55-SATB1可以在前列腺癌細胞中特異性增殖,干擾SATB1基因的表達;ZD55-SATB1在體外對前列腺癌細胞具有較好殺傷、增殖抑制作用及抑制前列腺癌細胞侵襲作用;ZD55-SATB1可以有效抑制人前列腺癌裸鼠移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移、促進其凋亡,為前列腺癌的生物與基因治療奠定了基礎(chǔ)。第二部分荷載SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒聯(lián)合內(nèi)分泌、化療治療激素敏感性前列腺癌目的:觀察荷載SATB1基因sh RNA溶瘤腺病毒(ZD55-SATB1)聯(lián)合內(nèi)分泌、化療對激素敏感性前列腺癌的治療作用。方法:1.CCK8法觀察對激素敏感性前列腺癌LNCa P細胞的毒性作用和增殖抑制效果。2.Hoechst-33258染色、TUNEL檢測前列腺癌LNCa P細胞凋亡情況。3.Migration檢測前列腺癌LNCa P細胞的遷移。4.Invasion檢測前列腺癌LNCa P細胞的侵襲。5.Western blot檢測SATB1及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2,caspase-3和caspase-8的表達。6.構(gòu)建裸鼠前列腺癌LNCa P細胞皮下移植瘤模型,隨機分成8組:空白對照組(PBS組)、內(nèi)分泌治療組(ET組:手術(shù)去勢)、藥物治療組(DTX組)、病毒治療組(ZD55-SATB1組)、內(nèi)分泌治療聯(lián)合化療組(ET+DTX組)、病毒聯(lián)合內(nèi)分泌治療組(ZD55-SATB1+ET組)、病毒聯(lián)合化療組(ZD55-SATB1+DTX組)、病毒聯(lián)合化療及內(nèi)分泌治療組(ET+DTX+ZD55-SATB1組)。7.測量腫瘤體積,繪制腫瘤時間-體積生長曲線。8.HE染色觀察腫瘤細胞的生長。9.免疫組化檢測腫瘤組織中caspase-3、caspase-8、Bcl-2和CD31蛋白的表達。結(jié)果:1.CCK-8結(jié)果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1聯(lián)合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS分別作用LNCa P細胞,48h后的存活率分別為(37.61±2.17)%、(65.32±5.06)%、(72.25±3.40)%、(55.94±3.97)%、(89.67±4.62)%、(81.17±2.19)%。ZD55-SATB1聯(lián)合DTX組分別與單用ZD55-SATB1組、ZD55-EGFP組、DTX組、Sitelong組和PBS組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。ZD55-SATB1聯(lián)合DTX組與Sitelong組比較,對LNCa P細胞增殖的抑制作用更明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),說明ZD55-SATB1聯(lián)合DTX及去除十一酸睪酮的聯(lián)合,對細胞增殖抑制作用較僅病毒聯(lián)合化療進一步增強。2.Hoechst33258結(jié)果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1聯(lián)合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS組凋亡率(%)分別為:64.00±6.52、52.67±8.14、33.33±3.59、36.52±7.84、5.71±2.26和6.01±4.64,聯(lián)合組與單一治療組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),說明聯(lián)合治療具有較強的促凋亡作用。3.Migration實驗結(jié)果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1聯(lián)合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS分別作用LNCa P細胞,培養(yǎng)24h后,穿膜細胞數(shù)分別為27.23±7.14、35.10±2.38、40.31±2.59、68.46±3.58、118.01±5.64和106.24±10.35,聯(lián)合組與單一治療組比較,遷移細胞明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)有意義(P0.01)。4.Invasion實驗結(jié)果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1聯(lián)合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS分別作用LNCa P細胞,培養(yǎng)24h后計算穿膜細胞數(shù)分別為12.31±0.41、21.93±2.11、26.12±2.13、25.06±1.89、76.82±4.31和68.62±4.22,聯(lián)合組與其它各組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)有意義(P0.01)5.TUNEL實驗結(jié)果:5.0MOI的病毒ZD55-SATB1聯(lián)合1ng/ml的DTX、10MOI的ZD55-SATB1、10MOI的ZD55-EGFP、2ng/ml的DTX、100ng/ml的Sitelong和PBS處理48h后,各組的凋亡率分別為(31.13±6.88)%、(14.70±3.84)%、(12.29±5.26)%、(13.802±4.74)%、(4.36±2.23)%、(9.48±3.19)%。聯(lián)合組多于單一治療組,與PBS組相比,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。6.Western blot實驗結(jié)果:5.0MOI的ZD55-SATB1聯(lián)合1.0ng/m L的DTX、10.0MOI的ZD55-SATB1、10.0 MOI的ZD55-EGFP、2.0ng/m L的DTX、100.0 ng/m L的Sitelong組、PBS組SATB1蛋白的相對表達量分別為5.35±1.49、12.73±7.80、29.02±3.54、45.37±3.76、80.03±4.02、和91.72±4.45,聯(lián)合組SATB1蛋白的表達量較其它各組明顯減低(P0.05),說明腺病毒ZD55-SATB1聯(lián)合DTX可明顯抑制SATB1蛋白的表達且DTX不影響ZD55-SATB1的沉默效果。ZD55-SATB1組與其它單一治療組比較,SATB1蛋白的表達量差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),表明ZD55-SATB1可有效沉默SATB1基因,抑制SATB1蛋白的表達。各治療組Bcl-2的表達量顯著降低,caspase-3和caspase-8的表達量均增多,與單藥物治療組相比,聯(lián)合組對凋亡蛋白的影響更為顯著(P0.05),7.移植瘤體積:病毒聯(lián)合化療及內(nèi)分泌治療組、病毒聯(lián)合化療組、內(nèi)分泌治療聯(lián)合化療組、病毒聯(lián)合內(nèi)分泌治療組、病毒治療組、化療組、內(nèi)分泌治療組和空白對照組移植瘤終體積分別為264.92±28.88、555.64±254.89、555.64±254.89、1589.47±300.91、787.52±221.15、1127.25±271.93、1679.58±258.82、2287.41±254.89和2602.13±325.74。病毒聯(lián)合化療及內(nèi)分泌治療組療效最強,顯著小于空白對照組以及單藥治療組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。8.HE染色:內(nèi)分泌治療組、化療組、病毒治療組、病毒聯(lián)合內(nèi)分泌治療組、內(nèi)分泌治療聯(lián)合化療組、病毒聯(lián)合化療組、病毒聯(lián)合化療及內(nèi)分泌治療組的腫瘤組織中均可見較多的死細胞,細胞裂解成碎片,細胞核固縮碎裂,其正常的組織結(jié)構(gòu)消失,但聯(lián)合組的腫瘤細胞壞死更明顯。9.免疫組化法檢測腫瘤組織中caspase-3、caspase-8、Bcl-2和CD31蛋白的表達:聯(lián)合組與單用藥物或病毒組相比,caspase-3、caspase-8蛋白表達量增多,Bcl-2蛋白表達量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。另一方面,與單用藥物或病毒組相比,聯(lián)合組移植瘤組織中CD31蛋白的表達量顯著降低,說明聯(lián)合組能夠有效促進促凋亡蛋白的表達,降低抑凋亡蛋白的表達,且能在一定程度上抑制腫瘤組織血管的生成。結(jié)論:1.體外實驗表明:溶瘤腺病毒和多西他賽對前列腺癌LNCa P細胞均有殺傷作用,體外給予Sitelong可促進LNCa P細胞的增殖。同時,溶瘤腺病毒聯(lián)合多西他賽及去雄激素治療可協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤效果。2.體內(nèi)實驗表明:溶瘤腺病毒、多西他賽和手術(shù)去勢均抑制前列腺癌LNCa P細胞皮下移植瘤的生長,且聯(lián)合效果優(yōu)于單一用藥,其可能的機制包括抑制腫瘤細胞生長、誘導(dǎo)凋亡、抑制血管生成。
【圖文】：

荷載 SATB1 基因 shRNA 的溶瘤腺病毒靶向治療前 表達最低，侵襲力亦最弱，進一步研究發(fā)現(xiàn)，有效沉默 SATB1 基因 細胞株的侵襲力顯著降低；同時，高效表達 SATB1 基因后，LNCaP 細著增強，，進一步證實 SATB1 基因在前列腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重能是前列腺癌治療的理想靶點，以上研究發(fā)表在 J Transl Med. (2013 ,IF 3.99)[18-19]。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.25

【參考文獻】

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本文編號：2683210