【摘要】：為研究櫛孔扇貝貝殼形成機理,首先應用質譜分析的方法,研究了幾丁質酶在櫛孔扇貝貝殼的蛋白質組中所占的比例。進一步利用RACE技術克隆獲得櫛孔扇貝幾丁質酶的c DNA,全長共1587 bp,可編碼439個氨基酸殘基。氨基酸序列的功能結構域分析表明,該幾丁質酶具有保守的幾丁質酶特征結構域。組織表達分析表明,櫛孔扇貝幾丁質酶在外套膜組織中表達量最高,并且在外套膜邊緣的表達量高于外套膜中心,推測其參與了貝殼的形成。應用實時定量PCR方法,檢測貝殼損傷修復過程中基因表達水平,結果顯示,幾丁質酶基因表達水平呈現下調趨勢,暗示其作為負調控因子參與貝殼修復過程。利用RNAi技術降低外套膜組織中幾丁質酶基因的表達水平,同時應用掃描電子顯微鏡觀察貝殼內表面的結構,發(fā)現貝殼礦物晶體片層的輪廓呈現不規(guī)則沉積。綜合以上實驗結果,推測幾丁質酶通過水解幾丁質來保證有機框架的有序性,從而對貝殼形狀和外觀起到調控作用。研究幾丁質酶的基因組織表達規(guī)律及其生物學功能,將有助于揭示貝殼生物礦化的機制。
【圖文】：

縉誥途齠?了貝殼晶體的結構。參與幾丁質生理過程相關的所有酶類中，幾丁質合成酶(chitinsynthetase,CS)[24]與幾丁質酶的作用最為突出。幾丁質合成酶是一種膜結合的糖苷轉化酶，在其作用下可以將幾丁質前體物合成幾丁質，促使幾丁質分子的延長；而幾丁質酶則催化幾丁質的水解過程。二者相反相成的作用在生物體內共同控制幾丁質的合成與水解，以保證生物體幾丁質相關的生理過程有序進行。幾丁質合成酶是一種膜結合蛋白，其氨基酸序列不存在信號肽，屬于非分泌蛋白；而幾丁質酶是一種分泌蛋白，因此在本研究中的蛋圖2櫛孔扇貝幾丁質酶基因組織分布與缺刻實驗實時定量PCR結果(a)櫛孔扇貝不同組織中幾丁質酶基因表達情況；1.外套膜邊緣；2.外套膜中心；3.鰓；4.足；5.生殖腺；6.內臟團；7.閉殼��；(b)缺刻處理后幾丁質酶基因的表達情況Fig.2Real-timequantitativePCRresultsofthechitinasetissueexpressionlevelandshellnotching(a)relativegeneexpressionlevelsofchitinaseindifferenttissuesofC.farreri;1.mantleedge;2.mantlepallial;3.gill;4.foot;5.gonad;6.visceralmass;7.adductormuscle;(b)responseofthechitinasegeneduringshellregenerationaftershellnotching圖3RNA干擾實驗*.與對照組差異極顯著，P<0.01Fig.3RNAiassay*.significantdifferencewithcontrolgroup,P<0.012期王俊，等：櫛孔扇貝幾丁質酶基因的克隆及功能鑒定193http://www.scxuebao.cn

因此推測，幾丁質酶可能在這一過程中開始表達，被分泌到貝殼上并在框架的修飾過程以及分解多余幾丁質的過程中發(fā)揮作用。而當貝殼的生長達到一定的成熟程度時，櫛孔扇貝體內的幾丁質合成酶和幾丁質酶的表達就趨于平衡，以維持整個貝殼的正常形態(tài)和生長趨勢。在軟體動物中，外套膜是生物礦化過程的重要部位，許多與礦化過程直接相關的分泌蛋白都在外套膜中大量表達并分泌到體外實行其礦化功能。本研究中幾丁質酶的表達具有明顯的組織特異性，在外套膜組織中的表達水平顯著高于其他組織，也暗示了其在礦化過程中的圖4掃描電子顯微鏡觀察貝殼結構(a)空白對照(注射200μL無酶水)；(b)陰性對照(注射40μgofGFP-dsRNA/200μL無酶水)；(c)實驗組(注射40μgofcht-dsRNA/200μL無酶水)；(d)實驗組(注射80μgofcht-dsRNA/200μL無酶水)Fig.4ThestructuralobservationoftheshellbySEM(a)groupinjectedwith200μLofDNase/RNase-freewater;(b)groupinjectedwith40μgofGFP-dsRNAdilutedin200μLofwater;(c)groupinjectedwith40μgofchitinase-dsRNAdilutedin200μLofwater;(d)groupinjectedwith80μgofchitinase-dsRNAdilutedin200μLofwater194水產學報41卷http://www.scxuebao.cn

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