【摘要】：目的:構(gòu)建核蛋白1-短發(fā)夾RNA(NUPR1-shRNA)慢病毒載體定向敲低NUPR1基因,研究NUPR1基因下調(diào)對人多發(fā)性骨髓瘤U266和RPMI8226細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能機(jī)制。方法:以健康人骨髓單個核細(xì)胞為對照,通過實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測骨髓瘤U266和RPMI8226細(xì)胞及MM患者骨髓細(xì)胞NUPR1 mRNA水平。設(shè)計針對NUPR1基因的shRNA序列并包裝慢病毒載體;篩選最佳靶點(diǎn),分別感染U266和RPMI8226細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)觀察轉(zhuǎn)染效率;qRT-PCR、Western blot法驗(yàn)證NUPR1基因干擾效果。CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和周期,qRT-PCR、Western blot檢測增殖和凋亡相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)。結(jié)果:與健康人骨髓單個核細(xì)胞相比,MM細(xì)胞系(U266和RPMI8226)和MM病人骨髓細(xì)胞NUPRImRNA水平增高。慢病毒載體構(gòu)建成功,兩細(xì)胞系慢病毒感染效率均達(dá)80%以上;qRT-PCR和Western blot顯示NUPR1-shRNA2慢病毒敲低效果最好,為最佳靶點(diǎn)。與對照組相比,敲低NUPR1表達(dá)后,U266和RPMI8226細(xì)胞增殖活力明顯減弱;下調(diào)NUPR1表達(dá)后,U266和RPMI8226細(xì)胞凋亡率明顯增加(P0.05);NUPR1下調(diào)組細(xì)胞較對照組細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯(P0.01)。與陰性對照組相比,qRT-PCR和Western blot顯示Bcl-2、PCNA水平明顯下調(diào),PTEN水平顯著升高;同時cleaved caspase-3、cleaved caspase-8 和 cleaved caspase-9 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。結(jié)論:與健康人骨髓單個核細(xì)胞相比,U266、RPMI8226細(xì)胞和MM病人骨髓細(xì)胞NUPR1表達(dá)水平較高。敲低U266和RPMI8226細(xì)胞NUPR1,可明顯抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。其機(jī)制可能是敲低NUPR1后可激活線粒體凋亡通路和調(diào)控PCNA及PTEN的表達(dá)。提示NUPR1在MM中是一個促癌基因,其有可能成為MM治療的潛在靶點(diǎn)。
【圖文】：

骨髓標(biāo)本（１２例）及正常人（４例）骨髓單個核細(xì)胞中表達(dá)水平。結(jié)果表明，ＮＵＰＲ１逡逑ｍＲＮＡ在ＭＭ細(xì)胞系（Ｕ２６６、ＲＰＭＩ８２２６）與ＭＭ患者骨髓細(xì)胞表達(dá)水平明顯高逡逑于正常人骨髓單個核細(xì)胞（圖１）。逡逑１６逡逑

２．２測序結(jié)果逡逑將所構(gòu)建的三條ＮＵＰＲｌ－ｓｈＲＮＡ－ＬＶ陽性克隆重組體進(jìn)行測序檢測，測序結(jié)果逡逑顯示載體序列構(gòu)建成功，無序列突變（圖２）。逡逑２？０邐２１＿邐２２０邐２３０邐２？＿邐ＺＳＯ邐２？０邐２７＊逡逑ＡＣ邋ＧＡ邋ＡＡＣＡＣＣ邋Ｇ邋Ｇ邋ｋ邋ＡＧ邋Ａ邋ＡＡＧＣＴＡＣＡＣ邋Ａ邋ｌ邋Ｇ邋ＡＪ．ＡＣＴＣ邋ＴＣＧ邋ＡＧ邋ＡＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧＣＴ邋ＴＴＣＴＴＴ邋ＴＴＴＴＧＡＡＴＴＣＧ邋Ｇ逡逑ｋｉｈＳｉｉｋＵｉｌｌＫｋ逡逑＾ｋｉｋＣｋＣＣＣＣＧｋＣＣｋｋｅＣＴ邋Ｃ邋Ｃ＊邋１Ｃ邋１ＡＴＴＣＡ邋Ｃ邋ｉ邋ＣＴＣ６邋＊ＧＴＣ邋Ｔ邋Ｃ＊＊邋ｉ邋Ｔ邋Ｔ邋Ｃ邋Ｔ邋Ｃ邋Ｃ邋ｋＣ邋ＣＴＴＣ６ＴＣＴ邋Ｔ邋Ｔ邋ＴＴ６ＡＡＴＴＣ邋ＯＣＡ邋Ｔ逡逑ＡＡＡＣＡＣＣＯＧＯＡＧＧ邋ＡＡＡＣＴＯＣＴＯＡＣＣＡＡＧＣＴＣＴＣＯＡＧ＆ＯＣＴＴＧＯＴＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＯＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣ逡逑圖２陽性克隆測序結(jié)果逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃ
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R733.3

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本文編號：2682047