【摘要】：哺乳動物的肢體發(fā)育涉及細胞增殖、分化、遷徙和凋亡,同源異形盒基因(HOX)、音猬因子(Sonic hedgehog,SHH)、成纖維生長因子(fibroblast growth factor,FGF)和WNT信號通路在其中發(fā)揮重要作用。肢體發(fā)育初期的肢芽主要由頂外胚層嵴(AER),漸進帶(PZ)和極性活化區(qū)(ZPA)三部分組成。AER區(qū)是肢體生長的主要信號中心,表達一些FGF家族成員基因,如Fgf4和Fgf8。PZ區(qū)為AER內(nèi)側(cè)有著旺盛分裂能力的間質(zhì)細胞區(qū)域,主要由Hoxa基因簇和Hoxd基因簇調(diào)控。ZPA區(qū)存在于肢芽的后側(cè),SHH和骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMPs)等基因在其中起到表達調(diào)控作用。也有文獻報道,肢體發(fā)育異常也會并發(fā)不孕不育癥。由于本實驗后肢性狀有不完全的外顯率,但母體相關(guān)的胚胎致死表型十分穩(wěn)定,因此本實驗以胚胎致死的表型為QTL的定位標準。首先,將性狀小鼠與C57BL/6品系小鼠雜交,建立F2代同類系小鼠實驗動物模型。在8號染色體上的相關(guān)區(qū)段,選擇平均分布的4個SNP位點,再通過使用聚合酶鏈式反應(yīng)-連接酶檢測法(PCR-LDR)分型技術(shù),對小鼠進行基因分型。通過對相關(guān)QTL精細定位后,本實驗成功地將之前粗略定位的小鼠8號染色體上的10Mb縮短到2.5Mb(68.3-70.8Mb)。并通過MGI小鼠基因數(shù)據(jù)庫上相關(guān)QTL區(qū)段的基因信息與小鼠二代測序信息比對,初步篩選出10個候選基因。接著,本實驗為研究小鼠胚胎后肢發(fā)育階段(E10.5,E11.5,E12.5,E13.5)相關(guān)基因(主要為Hox基因家族)與候選基因的共表達情況,挑選了一個候選基因Pbx4,與Hox基因家族、Wnt5a、Pitx1、Fgf8、Shh等43個與肢體發(fā)育相關(guān)的基因建立了表達譜,并建立了q PCR array技術(shù)手段,用于后續(xù)實驗的大量候選基因研究工作。首先,選取了Hox基因家族、Wnt5a、Pitx1、Fgf8、Pbx4、Shh等44個與肢體發(fā)育相關(guān)的基因為檢測基因,選取β-actin和Gapdh為看家基因,同時還設(shè)置了基因陰性對照組和樣品陰性對照組,然后以加熱烘干的方法將基因引物固定在PCR板上,加入樣品和qPCR反應(yīng)物,進行實時定量PCR反應(yīng)。然后,對建立的qPCR array進行了評估工作,通過樣品梯度稀釋的方法檢驗了其擴增效率;統(tǒng)計所有表達譜基因的Ct值標準差,評估了該方案的重復性;通過qPCR array的溶解曲線和PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳證明了該技術(shù)手段特異性強的優(yōu)點。通過已建立的qPCR array檢測了C57BL/6(簡稱B6)品系小鼠胚胎后肢發(fā)育時期Hox家族、Wnt5a、Pitx1、Fgf8、Pbx4、Shh等基因的表達差異。以E10.5為對照,檢測出在后肢發(fā)育時期基因有著兩種共表達模式,即Hoxb6、Hoxb8、Hoxc8、Hoxc9、Hoxc10、Hoxd9、Shh、Hoxc9、Hoxc10、Hoxc11、Hoxd9、Hoxd12、Fgf8和Pitx1等基因的相對表達量呈先上調(diào)后下調(diào)的表達模式;Hoxa11、Hoxa13、Hoxc12、Hoxc13、Hoxd13等基因表達出現(xiàn)下調(diào),候選基因Pbx4的相對表達水平與這種共表達模式相似。另外也有少部分Hox基因在小鼠后肢發(fā)育時期表達水平無明顯變化。綜上所述,本實驗第一部分首先對肢體發(fā)育缺陷及胚胎致死的小鼠進行了染色體上相關(guān)QTL的精細定位,初步篩選了挑選候選基因。第二部分實驗為研究小鼠胚胎時期后肢發(fā)育相關(guān)基因的表達狀況,建立了高效穩(wěn)定、特異性強且重復性好的qPCR array基因檢測方案,檢測結(jié)果描述了在C57BL/6品系小鼠胚胎肢體發(fā)育期Hox基因家族、Wnt5a、Pitx1、Fgf8、Pbx4、Shh等基因的相對表達差異,建立了后肢發(fā)育基因表達譜,為肢體發(fā)育研究工作開辟了新思路,也為之后的研究工作提供了小型數(shù)據(jù)庫,對肢體發(fā)育過程中探索Hox基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。
【圖文】：

在后肢中形成股骨、脛骨、腓骨、跗骨、跖骨和趾骨[28-30]，如下圖1-1b所示。圖1-1 前肢和后肢骨骼圖1.1.1.1 肢芽的結(jié)構(gòu)與發(fā)育在肢體發(fā)育研究中，由于操作的簡便性，雞胚成為了早期研究肢體發(fā)育的重要對象，主要用來進行相關(guān)組織結(jié)構(gòu)的研究和一些移植實驗[31-34]。早期對于雞胚的研究，，使我們認清了肢體發(fā)育中細胞間的互作模式和發(fā)育過程，為后續(xù)的分子學實驗打下了研究基礎(chǔ)。最近的十多年，在分子生物學領(lǐng)域，由于生物信息學領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展和實驗技術(shù)手段不斷的更新?lián)Q代，小鼠和斑馬魚逐漸成為科學家研究肢體發(fā)育的主要動物模型[35-39]。

致死相關(guān) QTL 的精細定位和后肢發(fā)育基因表達譜的檢測4圖1-2 肢芽發(fā)育階段基因的表達調(diào)控1.1.2 頂外胚層嵴、漸進帶和極性活化區(qū)的研究現(xiàn)狀肢芽的三個信號中心：AER、PZ和ZPA區(qū)一直以來都是肢體發(fā)育研究領(lǐng)域的研究熱點。關(guān)于三個信號中心的發(fā)育模式，現(xiàn)代科學一直未作出清楚的解釋，有兩種觀點一直爭執(zhí)不下，這兩種觀點也是現(xiàn)代科學公認的兩種主流的肢芽發(fā)育模式，即三個信號區(qū)共同增厚，共同發(fā)育生長；或是三個信號中心似年輪狀，逐個發(fā)育生長。但無論是哪種生長發(fā)育模式，都是要在三個信號中心相互作用、互相調(diào)控下，才能完成肢體的正常生長發(fā)育[54]。1.1.2.1 頂外胚層嵴的研究進展頂外胚層嵴（AER區(qū)）通常被定義為肢體發(fā)育末端被增厚的上皮細胞，它覆蓋在胚胎外周皮上，環(huán)背-腹軸（D-V軸）邊界
【學位授予單位】：東華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q344

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本文編號：2681236