【摘要】：遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證是研究基因功能的重要手段,是現(xiàn)代分子育種的重要途徑。自1986年首次報(bào)道黃瓜轉(zhuǎn)基因的數(shù)十年以來(lái),已有大量科研人員致力于黃瓜轉(zhuǎn)基因體系的開發(fā)和改良。但是已報(bào)道的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率差異較大,轉(zhuǎn)化體系不穩(wěn)定,缺乏試驗(yàn)細(xì)節(jié),制約著黃瓜基因功能研究與分子育種,因此急需開發(fā)穩(wěn)定、可靠、廣適性的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系。嫩果果皮顏色是黃瓜重要的外觀品質(zhì),是影響消費(fèi)者消費(fèi)選擇的重要因素。白皮黃瓜作為傳統(tǒng)特色黃瓜之一,目前在我國(guó)各地作為特色黃瓜相繼引種發(fā)展,但黃瓜嫩果皮性狀的調(diào)控基因及調(diào)控機(jī)理尚不明確,制約白皮黃瓜的分子設(shè)計(jì)育種。本研究從現(xiàn)有遺傳轉(zhuǎn)化體系著手,通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系中的多個(gè)參數(shù),建立黃瓜高效遺傳轉(zhuǎn)化體系。利用經(jīng)典圖位克隆技術(shù)定位和克隆白色嫩果皮調(diào)控基因w,并對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證。研究取得以下主要成果:(1)黃瓜高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立以美國(guó)切片黃瓜Poinsett76為試材,構(gòu)建pCAMBIA2301-LL超表達(dá)載體,使用農(nóng)桿菌菌株AGL1進(jìn)行介導(dǎo),通過(guò)超表達(dá)調(diào)控黃瓜葉片大小基因LITTLE LEAF(LL)建立黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化體系。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),種子在28℃下催芽2d后,靠近頂端生長(zhǎng)點(diǎn)處1/3-1/2的子葉部分是較為理想的外植體,切口處避免殘留頂端分生組織。AGL1侵染液的最適濃度(OD_(600))為0.7-0.8。農(nóng)桿菌與外植體在23℃條件下共培養(yǎng)2天可以比28℃誘導(dǎo)出更多的不定芽。共培養(yǎng)結(jié)束后挑取外觀為黃綠色的外植體進(jìn)行分化培養(yǎng),最佳分化培養(yǎng)基配方為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA,用卡那霉素篩選陽(yáng)性不定芽的最適濃度為100 mg/L。不定芽經(jīng)繼代培養(yǎng)一次可顯著提高轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率。轉(zhuǎn)基因植株在T0代即可看到葉片比野生型明顯變大。本遺傳轉(zhuǎn)化體系的平均轉(zhuǎn)化效率為0.5%。(2)黃瓜嫩果白色果皮調(diào)控基因w的精細(xì)定位用綠皮黃瓜Q30、WD3和白皮黃瓜Q24、B-2-2構(gòu)建Q30×Q24和WD3×B-2-2兩個(gè)雜交組合,分析6世代遺傳群體果皮顏色的分離比例,推測(cè)黃瓜嫩果白色果皮性狀由單核隱性基因(w)控制,綠色顯性于白色。用SSR和InDel標(biāo)記對(duì)Q30×Q24的2971株F_2單株進(jìn)行基因分型,經(jīng)連鎖分析與圖譜構(gòu)建,將w基因定位在3號(hào)染色體33.0 kb范圍內(nèi),含4個(gè)候選基因,其中基因peroxidase superfamily protein(PSP)和Arabidopsis two-component response regulator-like(APRR2)的表達(dá)量及氨基酸序列在雙親間存在差異。為進(jìn)一步確定w基因的候選基因,本研究將F_2定位群體擴(kuò)大至9497株,依據(jù)雙親全基因組序列數(shù)據(jù)進(jìn)一步開發(fā)InDel和SNP標(biāo)記,最終將w基因定位在3號(hào)染色體8.2 kb范圍內(nèi),只包含一個(gè)候選基因APRR2。(3)APRR2基因的克隆與功能初步分析以黃瓜材料9930中APRR2的cDNA序列為模板設(shè)計(jì)克隆引物,擴(kuò)增得到Q30與Q24中APRR2基因的cDNA序列全長(zhǎng)分別為1566bp和1567bp,均含12個(gè)外顯子,Q24在第9個(gè)外顯子末端有一個(gè)單核苷酸(G)的插入。對(duì)其他4個(gè)綠皮和4個(gè)白皮材料的的APRR2編碼序列進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)所有白皮材料相對(duì)綠皮材料都有該核苷酸的插入。利用NCBI ORF Finder預(yù)測(cè)該基因的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)該G堿基的插入導(dǎo)致等位基因aprr2在白皮黃瓜材料中發(fā)生移碼突變,使翻譯提前終止,相對(duì)綠色材料缺失了末端的101個(gè)氨基酸。作為與植物成熟相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)APRR2的表達(dá)量隨著Q30果實(shí)的成熟呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),且各個(gè)時(shí)期的表達(dá)量均高于Q24。光學(xué)顯微觀察發(fā)現(xiàn)Q30果皮中葉綠素含量、葉綠體的數(shù)量及葉綠體的綠色程度均顯著高于Q24。亞顯微結(jié)構(gòu)觀察進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Q30葉綠體中的類囊體結(jié)構(gòu)平整,堆疊有序、致密,基粒數(shù)目較多,且排列規(guī)則,而Q24的葉綠體類囊體呈現(xiàn)扭曲狀,堆疊松散,基粒數(shù)目較少,排列不規(guī)則,說(shuō)明Q24的白皮性狀可能是由于APRR2發(fā)生突變后,導(dǎo)致葉綠體發(fā)育不正常,葉綠素不能正常合成所致。(4)APRR2基因功能的遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證依照超表達(dá)LL基因所建立的黃瓜高效遺傳轉(zhuǎn)化體系,構(gòu)建APRR2基因的RNA干擾載體,通過(guò)干擾Poinsett76中APRR2基因的表達(dá),從獲得的10株P(guān)CR陽(yáng)性幼苗中,發(fā)現(xiàn)有2株轉(zhuǎn)基因植株的果皮顏色由深綠色被干擾成淺綠色,證明APRR2基因可以調(diào)控綠色果皮的形成。本研究建立了一個(gè)穩(wěn)定、高效的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系。通過(guò)正向和反向遺傳學(xué)方法克隆和驗(yàn)證了白色嫩果果皮基因APRR2,豐富和發(fā)展了黃瓜皮色遺傳理論,為黃瓜皮色育種提供了可直接利用的分子標(biāo)記和基因。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S642.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2674154