發(fā)布時(shí)間：2020-05-21 05:58

【摘要】：中國(guó)水仙(iVNaricissus tazetta var.Chinensis)屬于石蒜科多年生草本植物,是中國(guó)傳統(tǒng)著名球根花卉,擁有誘人的花的形狀和氣味,在世界花卉市場(chǎng)上有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。但是中國(guó)水仙很多農(nóng)藝性狀需要被改良,比如說(shuō)顏色。然而中國(guó)水仙是三倍體,主要通過(guò)無(wú)性繁殖方法進(jìn)行繁殖,傳統(tǒng)的雜交育種方法難以用于遺傳改良�；蚬こ碳夹g(shù)的發(fā)展使中國(guó)水仙品種創(chuàng)新成為可能,改變花瓣顏色可以通過(guò)基因工程技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。水仙品種中的黃酮類化合物被發(fā)現(xiàn)主要是黃酮醇,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)花青素的存在。因此,研究水仙為什么沒(méi)有花青素生物合成分子機(jī)制將會(huì)有助于開發(fā)多種花色的水仙品種。黃酮類化合物廣泛分布在植物體內(nèi),包括黃酮,異黃酮,黃酮醇,花青素和原花色素。R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在黃酮類代謝途徑的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。本研究從中國(guó)水仙克隆出3個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子NtMYB2、NtMYB3和NtMYB4,并對(duì)其功能進(jìn)行了研究,結(jié)果如下。1.利用3' RACE-PCR方法分離到NtMYB2 ORF3'端,進(jìn)而得到該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列。NtMYB2 ORF含有783 bp的核苷酸,編碼251個(gè)氨基酸殘基。用RT-PCR方法克隆得到NtMYB3基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列,NtMYB3 ORF全長(zhǎng)606bp,編碼201個(gè)氨基酸。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),NtMYB2和NtMYB3都屬于R2R3-MYB,在R3重復(fù)序列中具有與bHLH-相互作用基序[D/E]Lx2[R/K]x3Lx6Lx3R和DNEI基序。進(jìn)一步分析表明NtMYB2和NtMYB3屬于R2R3-MYB第4亞組的轉(zhuǎn)錄因子,該亞組為R2R3-MYB抑制因子,參與花青素和黃酮類物質(zhì)的調(diào)控。NtMYB2和NtMYB3同第4亞組的其他成員一樣,在C端含有C2阻遏基序。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明,NtMYB2和NtMYB3屬于抑制因子的MYB 4-like分支。RT-PCR克隆得到另一個(gè)R2R3-MYB基因家族成員NtMYB4的。序列分析表明除R2、R3保守區(qū)外,NtMYB4在C-末端顯示保守的基序“NF/YWSV/MEDF/LW”,與R2R3-MYB第19亞組基因序列相似。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明,NtMYB4與花特異R2R3-MYB因子聚為一類。亞細(xì)胞定位分析顯示NtMYB2、NtMYB3、NtMYB4均為核蛋白。2.研究3個(gè)MYB基因在中國(guó)水仙不同組織器官以及花發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá),結(jié)果表明3個(gè)MYB基因有不同的表達(dá)形式。NtMYB2基因在中國(guó)水仙不同組織中都有表達(dá),但是在花瓣和花冠中的表達(dá)量高于葉片和鱗莖盤,并且在芽期的花瓣和副冠中轉(zhuǎn)錄水平顯著高于半開期以及完全開放期花瓣和花冠;NtMYB3在鱗莖盤中表達(dá)水平較高;NtMYB4在花瓣和副冠中的表達(dá)量較高,特別是在完全開放時(shí)期的花瓣和副冠中表達(dá)量較高。3.通過(guò)注射煙草葉片進(jìn)行基因瞬時(shí)表達(dá),結(jié)果表明陽(yáng)性對(duì)照StMYB單獨(dú)注射能誘導(dǎo)煙草葉片產(chǎn)生紅色,NtMYB2和NtMYB3分別與StMYB混合注射都能完全抑制StMYB誘導(dǎo)產(chǎn)生的紅色;NtMYB4與StMYB混合注射也能降低由stMYB誘導(dǎo)生成的紅色素,但是其抑制效果比NtMYB2和NtMYB3差。添加StbHLH不會(huì)減弱NtMYB2和NtMYB3的抑制效果,但是會(huì)降低NtMYB4的抑制效果。定量PCR分析瞬時(shí)表達(dá)煙草葉片中類黃酮合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),結(jié)果表明,StMYB激活了煙草中花青素合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),而3個(gè)MYB基因都能明顯抑制花青素合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。4.將3個(gè)R2R3-MYB基因構(gòu)建35S啟動(dòng)子植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草。NtMYB2在煙草中的過(guò)量表達(dá)顯著降低了轉(zhuǎn)基因煙草花的顏色,使煙草花瓣由粉紅色變成白色或者淡紅色,測(cè)定轉(zhuǎn)基因的花瓣中總花青素含量明顯低于野生型。除了花的顏色之外,轉(zhuǎn)基因花的大小和長(zhǎng)度都比野生型的要小。qRT-PCR分析表明,NtMYB2抑制了煙草類黃酮生物合成途徑關(guān)鍵基因的如CHS、CHI、F3H、DFR、ANS、UFGT、ANR和FLS等的轉(zhuǎn)錄水平,尤其是UFGT基因。轉(zhuǎn)基因煙草中NtMYB3的過(guò)量表達(dá)使花色由深粉紅色變?yōu)閹缀醢咨?NtMYB3轉(zhuǎn)基因花瓣中花青素含量低于野生型。除花色外,轉(zhuǎn)基因煙草還觀察到其他一些性狀變化,如花的大小和長(zhǎng)度均小于野生型。此外,轉(zhuǎn)基因煙草花中柱頭的位置高于花藥。qPCR結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因花瓣中花青素生物合成途徑的CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平明顯下降,黃酮醇分支的重要基因FLS的表達(dá)水平也明顯下降,而原花青素生物合成分支的ANR和LAR基因在轉(zhuǎn)基因花中的表達(dá)水平卻上升了。NNtMYB4在煙草中的過(guò)表達(dá)也改變花的顏色,轉(zhuǎn)基因花瓣顏色變淺甚至變?yōu)榘咨?測(cè)定花青素含量表明轉(zhuǎn)基因花瓣中花青素含量明顯下降。此外,在轉(zhuǎn)基因的花中還發(fā)現(xiàn)花的柱頭伸長(zhǎng)現(xiàn)象,同時(shí)發(fā)現(xiàn)NNtMYB4的過(guò)表達(dá)使部分植株矮化,小花和葉片變窄。qPCR分析表明,NtMYB4轉(zhuǎn)基因煙草花中花青素以及類黃酮生物合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平均有下降。5.研究結(jié)果顯示,NtMYB2,NtMYB3和NtMYB4都是類黃酮生物合成途徑的抑制因子。NtMYB2可能主要在中國(guó)水仙花瓣和副冠抑制類黃酮代謝,包括花青素、黃酮醇和原花青素的合成;NtMYB3可能主要在鱗莖盤上中抑制花青素和黃酮醇的合成,同時(shí)激活原花青素的生物合成的激活劑;NtMYB4也是黃酮類物質(zhì)生物合成的抑制因子,它可能通過(guò)與MYB激活因子競(jìng)爭(zhēng)bHLH的方式在水仙花瓣和副冠中發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S682.21

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 郭碧花;;中國(guó)水仙的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景探究[J];中外企業(yè)家;2018年03期

2 李文儀,孫景欣,傅家瑞;中國(guó)水仙(Narcissus tazetta L.var.Chinesis Roem)開花生理研究——Ⅰ.中國(guó)水仙的生物學(xué)特性及花芽分化的規(guī)律[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1985年01期

3 李文儀;孫景欣;傅家瑞;;中國(guó)水仙(Narcissus tazetta L.Var.Chinesis Roem)開花生理研究 2.貯藏期溫度處理對(duì)中國(guó)水仙鱗莖發(fā)育的影響[J];中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1987年04期

4 林奇力;黃德聰;曾文士;魏超;;熱水處理中國(guó)水仙線蟲效應(yīng)初報(bào)[J];福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào);1987年01期

5 許榮義;;中國(guó)水仙資源考察初報(bào)[J];福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào);1987年02期

6 陳振光;王天池;陳愛國(guó);;中國(guó)水仙品種選育的初步研究[J];福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào);1988年01期

7 許榮義;鄭天本;;自然生長(zhǎng)與栽培種中國(guó)水仙的切片觀察[J];福建農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào);1989年01期

8 彭鎮(zhèn)華;王雁;陳建清;;中國(guó)水仙[J];生態(tài)文明世界;2014年01期

9 葉如夢(mèng);姚婷婷;魏弋莘;潘東明;;高溫貯藏對(duì)生態(tài)休眠期中國(guó)水仙的影響[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2018年07期

10 林曉紅;陳鶯;潘東明;鐘嫻;潘騰飛;;銅離子對(duì)中國(guó)水仙生長(zhǎng)發(fā)育的影響[J];北方園藝;2015年12期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 鄭春明;;中國(guó)水仙織培快繁技術(shù)研究[A];中國(guó)植物生理學(xué)會(huì)第九次全國(guó)會(huì)議論文摘要匯編[C];2004年

2 陳德海;楊盛昌;吳曉梅;佘紫文;;中國(guó)水仙和歐洲水仙的子房培養(yǎng)[A];中國(guó)植物學(xué)會(huì)七十周年年會(huì)論文摘要匯編（1933—2003）[C];2003年

3 陳炯;陳劍平;;中國(guó)水仙花葉病病原的分子鑒定[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)第六屆青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集——植物病理學(xué)研究進(jìn)展（第五卷）[C];2003年

4 陳炯;陳劍平;;中國(guó)水仙花葉病病原的分子鑒定[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)第七屆代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要集[C];2002年

5 林毅雁;姜賀飛;蘇亞北;高健;趙惠恩;;不同栽培處理對(duì)中國(guó)水仙‘金盞銀臺(tái)’鱗莖質(zhì)量的影響[A];中國(guó)觀賞園藝研究進(jìn)展 2009[C];2009年

6 莊偉建;茅金為;;中國(guó)水仙二個(gè)地方品種核型和Giemsa C-帶的研究[A];中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會(huì)第五次會(huì)議論文摘要匯編[C];1992年

7 林江波;戴藝民;鄒暉;王偉英;林一心;吳水金;吳松海;;中國(guó)水仙愈傷組織誘導(dǎo)與小鱗莖再生[A];2008年福建省科協(xié)第八屆學(xué)術(shù)年會(huì)農(nóng)業(yè)分會(huì)場(chǎng)論文集[C];2008年

8 鞠玉棟;;中國(guó)水仙遺傳轉(zhuǎn)化受體體系的建立[A];2008年福建省科協(xié)第八屆學(xué)術(shù)年會(huì)農(nóng)業(yè)分會(huì)場(chǎng)論文集[C];2008年

9 于忠美;曹彬彬;金為民;史益敏;;葡萄風(fēng)信子種球繁殖與花期調(diào)控[A];2008園藝學(xué)進(jìn)展（第八輯）——中國(guó)園藝學(xué)會(huì)第八屆青年學(xué)術(shù)討論會(huì)暨現(xiàn)代園藝論壇論文集[C];2008年

10 曾黎輝;羅鵬;吳雪琴;;類黃酮合成途徑結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)分析與中國(guó)水仙不能合成花青素原因的初步解析[A];美麗大豐 球宿花開——中國(guó)球宿根花卉2015年會(huì)論文集[C];2015年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 許榮義;漳州水仙花史話[N];閩南日?qǐng)?bào);2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 Muhammad Anwar;中國(guó)水仙類黃酮代謝抑制基因NtMYB2,NtMYB3和NtMYB4的鑒定及功能研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2018年

2 陳林姣;中國(guó)水仙遺傳多樣性及其不育機(jī)理研究[D];廈門大學(xué);2006年

3 彭愛銘;中國(guó)水仙揮發(fā)性成分及影響因素分析[D];中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院;2010年

4 高健;鈷-60Gamma射線輻照中國(guó)水仙的誘變效應(yīng)和機(jī)理研究[D];中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院;2000年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 呂曉鋒;利用巴斯德畢赤酵母表達(dá)重組中國(guó)水仙凝集素的發(fā)酵工藝研究[D];北京化工大學(xué);2014年

2 莊曉英;中國(guó)水仙遺傳轉(zhuǎn)化及離體誘變體系的研究[D];浙江大學(xué);2005年

3 于小清;中國(guó)水仙凝集素基因的克隆與表達(dá)[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

4 鄒清成;中國(guó)水仙花色相關(guān)基因的分離和反義Psy基因的遺傳轉(zhuǎn)化[D];浙江大學(xué);2006年

5 江琳玉;中國(guó)水仙花色相關(guān)基因ZDS、LYCE的克隆[D];福建農(nóng)林大學(xué);2009年

6 欒愛業(yè);中國(guó)水仙不同花器官離體培養(yǎng)和鱗莖盤EMS離體誘變的研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2008年

7 馬傳營(yíng);中國(guó)水仙（Narcissus tazetta L.var.chinensis Roem）花香相關(guān)基因DXPS、DXR和PAL的克隆[D];福建農(nóng)林大學(xué);2010年

8 張慧平;中國(guó)水仙遺傳轉(zhuǎn)化及花色素成分分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2010年

9 陳靜;中國(guó)水仙花芽分化及胚胎學(xué)研究[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

10 姜賀飛;竹醋液對(duì)中國(guó)水仙鱗莖發(fā)育的影響[D];北京林業(yè)大學(xué);2011年

，

本文編號(hào)：2673821