【摘要】：巴西橡膠樹(shù)是天然橡膠的主要來(lái)源,并且是我國(guó)的戰(zhàn)略性物資,但我國(guó)天然橡膠自給率僅約為18%,提高橡膠產(chǎn)量是緩解我國(guó)天然橡膠供需矛盾的有效途徑。病害導(dǎo)致橡膠產(chǎn)量每年損失10～30%,是制約天然橡膠安全生產(chǎn)的主要因素之一。當(dāng)前的栽培措施與農(nóng)藥防治橡膠樹(shù)病害的能力有限,且長(zhǎng)期大量使用農(nóng)藥,對(duì)橡膠林土壤肥力保持、生態(tài)環(huán)境和人畜的安全都構(gòu)成很大威脅,故培育抗病高產(chǎn)品種成為我國(guó)乃至全世界產(chǎn)膠國(guó)家的橡膠樹(shù)育種的有效途徑。橡膠樹(shù)因本身為熱帶高大喬木,操作不易、遺傳上高度雜合、育種周期長(zhǎng)且環(huán)節(jié)多等多種因素影響,利用常規(guī)育種進(jìn)行品種改良進(jìn)展緩慢,轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用與抗病相關(guān)基因的克隆為橡膠樹(shù)分子抗病育種提供了新的途徑。遺傳轉(zhuǎn)化效率低是我國(guó)橡膠樹(shù)功能基因研究和抗病分子育種的瓶頸,優(yōu)良的遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)是提高橡膠樹(shù)植物再生和遺傳轉(zhuǎn)化效率的重要環(huán)節(jié)和前期基礎(chǔ)。本試驗(yàn)利用熱研7-33-97品種的橡膠樹(shù)花藥為外植體,通過(guò)花粉發(fā)育時(shí)期檢測(cè);胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、甄別和增殖等環(huán)節(jié)來(lái)優(yōu)化橡膠樹(shù)花藥愈傷組織,提高體細(xì)胞胚的分化、成熟和植株再生。創(chuàng)建了優(yōu)化胚性愈傷組織的保存方法,降低因頻繁繼代造成的愈傷組織胚性喪失和人工勞作的繁瑣。利用優(yōu)化的花藥胚性愈傷組織作為遺傳轉(zhuǎn)化受體,以根癌農(nóng)桿菌為介導(dǎo),GUS、GFP為報(bào)告基因,建立和優(yōu)化了橡膠樹(shù)花藥體細(xì)胞胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化體系,并利用該體系轉(zhuǎn)化橡膠樹(shù)HbCERK1基因。主要結(jié)果如下:1、熱研7-33-97橡膠樹(shù)品種雄花蕾縱徑約2.81～3.20 mm時(shí),花粉粒發(fā)育多為單核靠邊期,是誘導(dǎo)易碎爽脆型花藥脫分化愈傷組織的適宜外植體;雄花蕾縱徑是篩選外植體的適宜指標(biāo)。2、單�；ㄋ幗臃N是誘導(dǎo)橡膠樹(shù)易碎爽脆型花藥脫分化愈傷組織的適宜接種方式,比雄花整枚單體雄蕊接種方式的誘導(dǎo)率顯著提高了 60.6%。3、小球狀、易碎爽脆、顏色嫩黃是橡膠樹(shù)花藥胚性愈傷組織的典型特征,可借助解剖鏡進(jìn)行甄別,提高胚性愈傷組織的識(shí)別和利用效率。4、輔以花藥子葉形體細(xì)胞胚看護(hù)哺育甄選胚性愈傷組織,在體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng),是胚性愈傷組織快速增殖的適宜方式,增殖速率比正常增殖顯著增加2.9倍。5、優(yōu)化的花藥胚性愈傷組織的體細(xì)胞胚誘導(dǎo)分化率比花藥脫分化愈傷組織顯著提高2.04倍,體細(xì)胞胚總數(shù)和正常子葉胚數(shù)分別顯著增加了 69.2%和168.0%,植株再生率也顯著增加了 2.7倍。6、低溫冷藏胚性愈傷組織的相對(duì)生長(zhǎng)量比對(duì)照的顯著降低83.1%,但細(xì)胞活力相對(duì)強(qiáng);低溫冷藏胚性愈傷組織的SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶活性與對(duì)照無(wú)顯著差異,但GR酶活性比對(duì)照的顯著增加4.21倍;恢復(fù)(25±2)℃、正常增殖培養(yǎng),胚性愈傷組織的存活率、相對(duì)生長(zhǎng)量、體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率與對(duì)照的無(wú)顯著差異,但植株再生能力提高47.2%。7、優(yōu)化的花藥胚性愈傷組織是橡膠樹(shù)良好的遺傳轉(zhuǎn)化受體,以GUS、GFP為報(bào)告基因,建立了橡膠樹(shù)花藥胚性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化體系:以花藥胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體,通過(guò)無(wú)鈣離子培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)10 d,菌液侵染濃度OD600為0.6～1.0,侵染時(shí)間為20～40 min,暗培養(yǎng)共培養(yǎng)3 d,乙酰丁香酮(AS)濃度為100μM,其遺傳轉(zhuǎn)化率大于5%。8、利用建立的花藥胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化橡膠樹(shù)PTI先天免疫途徑基因HbCERK1,通過(guò)PCR、RT-PCR以及western blot等方法檢測(cè),確定外源基因HbCERK1成功導(dǎo)入整合到橡膠基因組DNA中。本研究?jī)?yōu)化了橡膠樹(shù)花藥胚性愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和保存,為今后適時(shí)提供橡膠樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化受體材料提供理論依據(jù)和方法;建立了穩(wěn)定的花藥胚性愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系,為完善橡膠樹(shù)高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ);轉(zhuǎn)橡膠樹(shù)HbCERK1的轉(zhuǎn)基因株系經(jīng)過(guò)擴(kuò)繁和移栽,可為后期進(jìn)行橡膠樹(shù)HbCERK1基因功能研究提供研究材料。
【圖文】：

期、花藥生理狀態(tài)等密切相關(guān)。逡逑將ｉ、ｉｉ和ｉｉｉ三組雄花以整枚花蕾的單體花藥剝離下接種到脫分化愈傷組織誘逡逑導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)４５邋ｄ后，如圖４所示，所誘導(dǎo)出的愈傷組織主要有三種類(lèi)型，逡逑第一種為爽脆、顏色嫩黃的易碎類(lèi)胚性愈傷組織，此類(lèi)愈傷組織進(jìn)一步誘導(dǎo)可形逡逑成胚性愈傷組織，后期分化體細(xì)胞胚狀體機(jī)率較高；第二種為松散、水浸狀褐色逡逑２４逡逑

源基因的優(yōu)良受體。前期易碎爽脆型的脫分化愈傷組織誘導(dǎo)，是后期胚性愈傷組逡逑織形成的首要環(huán)節(jié)和重要基礎(chǔ)。在合適的調(diào)控培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式下，與接種方式逡逑密切相關(guān)。如圖６所示，以ｉｉ組雄花（縱徑２．８１？３．２０邋ｍｍ，花粉發(fā)育時(shí)期主要逡逑為單核靠邊期）為外植體，分別以去掉花萼的整枚單體雄蕊（單體雄蕊）與剝離逡逑下單體雄蕊上的單粒花藥（單�；ㄋ帲┑慕臃N方式接種到愈傷組織脫分化誘導(dǎo)培逡逑養(yǎng)基中，，２５邋ｄ后，如圖７所示，以ｉｉ組雄花作為外植體來(lái)誘導(dǎo)花藥脫分化愈傷組逡逑織，以單體雄蕊和單�；ㄋ幗臃N，所誘導(dǎo)出的脫分化愈傷組織皆以鮮黃易碎爽脆逡逑型愈傷組織＆主
【學(xué)位授予單位】：海南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S794.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2670912