【摘要】：小麥莖稈是獲得高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的物質(zhì)基礎(chǔ),但是當(dāng)前小麥育種利用的莖稈發(fā)育調(diào)控基因主要為矮稈基因,其遺傳基礎(chǔ)日益狹窄。誘發(fā)突變技術(shù)可拓寬小麥的遺傳基礎(chǔ),發(fā)掘新的調(diào)控小麥莖稈發(fā)育的優(yōu)良基因。本實(shí)驗(yàn)室前期利用~7Li離子束誘變輪選987(LX987)獲得了一個快速發(fā)育突變體(qucik development mutant,qd),與野生型相比,qd拔節(jié)后的莖稈發(fā)育速率和強(qiáng)光誘導(dǎo)下的胚芽鞘顏色表現(xiàn)出明顯的表型差異。本研究綜合利用BSR-Seq、轉(zhuǎn)錄組和660K SNP芯片等技術(shù)對控制突變體的莖稈快速發(fā)育性狀的基因(命名為qd1)以及強(qiáng)光誘導(dǎo)下的花青素合成基因進(jìn)行初步定位。主要研究結(jié)果如下:1、小麥莖稈快速發(fā)育基因qd1的初定位。以輪選987×qd的F_2群體為材料,利用BSR-Seq技術(shù)在4B染色體上得到一個總長為13.55 Mb的區(qū)域,15.41 Mb-28.96 Mb。針對BSR-Seq開發(fā)的SNP,在目標(biāo)區(qū)間篩選到了16個KASP(kompetitive allele specifc PCR)標(biāo)記。在F_2群體的153株隱性單株中,利用這些KASP標(biāo)記對定位區(qū)間進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明與BSR-Seq得到的初定位區(qū)間有2.16 Mb的重疊區(qū)域(26.80 Mb-28.96 Mb),更進(jìn)一步縮小qd1初定位區(qū)間至5.08 Mb(26.80 Mb-31.88 Mb)。2、野生型與突變體的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析表明苯并惡嗪類生物合成通路顯著富集差異表達(dá)基因。赤霉素合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,內(nèi)根-古巴焦磷酸合成酶(ent-copalyl diphosphate synthase,CPS)和GA20ox出現(xiàn)了差異表達(dá)基因的富集。將每種酶對應(yīng)的所有差異表達(dá)基因的表達(dá)量FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)值進(jìn)行加和后,發(fā)現(xiàn)在突變體赤霉素合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,GA20ox表達(dá)量出現(xiàn)大幅下調(diào),推測孕穗期突變體莖稈伸長速率降低可能是由于該時期突變體GA20ox表達(dá)量的大幅下降引起的。3、突變體中受強(qiáng)光誘導(dǎo)的花青素合成基因的初定位。利用660K SNP芯片,發(fā)現(xiàn)兩個F_2群體(輪選987×qd,航麥247×qd)都在7A染色體存在三個一致的多態(tài)性SNP富集區(qū)。其中260Mb-290 MB區(qū)間多態(tài)性SNP富集的比例在兩個群體中均不低于30%,位于285 Mb處的R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子最有可能為候選基因。研究表明,綜合利用BSR-Seq和660K SNP芯片技術(shù)可對控制小麥莖稈發(fā)育速率和胚芽鞘花青素合成的關(guān)鍵基因進(jìn)行快速分析定位。研究結(jié)果為拓寬小麥莖稈發(fā)育調(diào)控基因的遺傳資源和深入解析花青素的生理功能奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

94℃預(yù)變性 15 min；（2）94℃變性 20 s，61-55℃退火延伸 1 min（每循環(huán)降低 0.6℃），持續(xù) 10個循環(huán)；（3）94℃變性 20 s，55℃退火延伸 1 min，進(jìn)行 26 個循環(huán)；（4）37℃持續(xù) 1 min 后進(jìn)行熒光采集實(shí)現(xiàn) SNP 基因分型。2.2 結(jié)果與分析2.2.1 測序數(shù)據(jù)與參考基因組的比對以及高質(zhì)量 SNP 的篩選測序產(chǎn)生出的原始數(shù)據(jù)去除測序接頭、引物序列以及過濾低質(zhì)量 reads 后，共得到 402.04 Mb雙端 reads（對應(yīng) 118.40 Gb Clean Data）。其中親本 reads 數(shù)目均不低于 25.40 Mb（7.49 Gb），混池 reads 數(shù)目均不低于 107.01 Mb（31.53 Gb）。各樣品 Q30 堿基百分比均不低于 94.9%，見附表A1。GATK 軟件將親本和混池的 Clean Reads 與參考基因組進(jìn)行比對后，共發(fā)掘出 393,257 個 SNP位點(diǎn)，利用四個標(biāo)準(zhǔn)過濾后，得到高質(zhì)量 SNP 位點(diǎn) 38,299 個（其中有 692 個 SNP 沒有比對到染色體），平均每 380 kb 一個 SNP，每條染色體平均覆蓋 1790 個 SNP，見圖 2.1。SNP 個數(shù)小于 1000的染色體有 2B、2D、3D、4A、4D、5D 和 7D。6B 和 3B 染色體上 SNP 數(shù)目最多，分別達(dá)到了4299 和 4209 個。4B 染色體上共有 1616 個 SNP，平均每 417 kb 一個 SNP。

對應(yīng) Mix-D 的 SNP-index 均值為 0.80。理論上隱性混池目標(biāo)區(qū)間所有 SNP 的 SNP-index 值應(yīng)為 1，但是混池 Mix-D 在目標(biāo)區(qū)間的最大 SNP-index 值為 0.81，可能是于 QTL 極易受環(huán)境或遺傳背景的影響致使選擇極端矮稈表型時混入了其他基因型的單株。F2群體對 qd1 初定位區(qū)間的驗(yàn)證見圖 2.3。利用目標(biāo)區(qū)間 SNP 信息開發(fā)的 16 個 KASP 標(biāo)記，對 153 株 F2隱性單株進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了 59 個重組子，其中 31.88 Mb、37.70 Mb 和 41.01 Mb 處，各有一個關(guān)鍵重組子，這三個重組子表明 qd1 位于 26.80 Mb-31.88 Mb 之間，共計 5.08 Mb 區(qū)間。這個結(jié)果與 QTL-Seq 得到的初定位區(qū)間有 2.16 Mb 的重疊區(qū)域（26.80 Mb-28.96 Mb），驗(yàn)證了QTL-Seq 得到定位區(qū)間的準(zhǔn)確性，更進(jìn)一步縮小 qd1 候選區(qū)間至 5.08 Mb（26.80 Mb-31.88 Mb）。實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果表明 qd 的 Rht-B1 基因的 190 位發(fā)生了 T-C 的轉(zhuǎn)換，造成其編碼的DELLA 蛋白的終止密碼子 TAG 回復(fù)突變?yōu)榫幋a谷氨酰胺的 CAG，因此 qd 的 DELLA 蛋白恢復(fù)為 621 個氨基酸長度，其與赤霉素的互作功能也恢復(fù)正常，，表現(xiàn)為對赤霉素敏感（張寧, 2016）。利用 Rht-B1 的 KASP 標(biāo)記（位于 30.86 Mb）對隱性單株進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明該標(biāo)記沒有重組子（圖 2.3），因此 qd1 很有可能位于 Rht-B1a 基因附近。在參考基因組的注釋中，qd1 定位區(qū)間（26.80Mb-31.88 Mb）包括 Rht-B1a 基因在內(nèi)，共有 70 個基因，但是并沒有與赤霉素的生物合成功能相關(guān)的基因，只有兩個編碼 F-box 蛋白的基因可能與赤霉素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能有關(guān)。這 70 個基因的詳細(xì)注釋信息見附表 A3。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S512.1

【參考文獻(xiàn)】

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