【摘要】：orf61是桿狀病毒晚期表達(dá)的核心基因之一。為了研究家蠶核型多角體病毒(Bm NPV)orf61基因的功能,利用Red重組技術(shù)與Bac-to-Bac系統(tǒng)分別敲除和異位補(bǔ)回orf61基因,構(gòu)建了orf61缺失型病毒orf61-ko-Bacmid以及補(bǔ)回型病毒orf61-reBacmid,然后分別轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞Bm N,調(diào)查orf61基因缺失對Bm NPV復(fù)制和不同時期基因轉(zhuǎn)錄的影響。檢測orf61基因缺失型病毒轉(zhuǎn)染Bm N細(xì)胞液上清中的病毒滴度為0,說明orf61基因缺失導(dǎo)致病毒不能形成有感染活性的芽生型病毒粒子(BV);熒光定量PCR分析orf61基因缺失會顯著地降低病毒基因組的復(fù)制水平,進(jìn)而導(dǎo)致病毒各個時期基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著下降(P0.01)。此外,通過體外EMSA試驗(yàn)和構(gòu)建雙熒光素酶報告基因系統(tǒng),檢測ORF61蛋白對多角體蛋白基因polh啟動子的調(diào)控作用,結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)是polh基因轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)節(jié)因子。研究結(jié)果有助于深入闡釋Bm NPV orf61基因在病毒基因組復(fù)制中的作用以及對極晚期表達(dá)的多角體蛋白基因polh的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
【圖文】：

的上、下游引物分別為OＲF61F和OＲF61Ｒ，cat基因擴(kuò)增的上、下游引物分別為catF和catＲ。用于重組基因擴(kuò)增的引物組合分別為OＲF61F和OＲF61Ｒ、OＲF61F和catＲ、catF和OＲF61Ｒ。引物序列見表1。1.3.2orf61補(bǔ)回型Bacmid的構(gòu)建根據(jù)orf61基因序列設(shè)計(jì)補(bǔ)回引物OＲF61reF和OＲF61reＲ，上游引物引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物引入KpnⅠ酶切位點(diǎn)，，PCＲ產(chǎn)物包含orf61基因上游啟動子序列共242bp。然后把擴(kuò)增的序列插入轉(zhuǎn)移載體pFast-Bac-HTB中，并利用Bac-to-Bac系統(tǒng)將序列轉(zhuǎn)座至Bacmid，獲得補(bǔ)回型Bacmid，鑒定方法同上。圖1orf61基因缺失型BmNPV病毒(A)和orf61基因補(bǔ)回型BmNPV病毒(B)的構(gòu)建策略示意圖Fig.1Schematicstrategyforconstructionoforf61knockoutBmNPVbacmid(A)andorf61rescuedBmNPVbacmid(B)

源蛋白的序列相似度分別為96%、91%、68%和54%(圖2-B)。利用最大簡約法構(gòu)建的OＲF61蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，BmNPV與AcM-NPV的親源關(guān)系較近，而與DekiNPV的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2-C)。B圖陰影示比對序列中的氨基酸殘基完全一致。Ⅰ—BmNPVOＲF61(NP_047478．1)，Ⅱ—AcMNPVOＲF75(NP_054105．1)，Ⅲ—MaviNPVOＲF58(YP_950788．1)，Ⅳ—ThorMNPVHypothetical(YP_007250482．1)，Ⅴ—CapoNPVOＲF6(YP_009255324．1)，Ⅵ—DekiNPVOＲF79(AFS51957．1)。BackgroundinpanelBindicateidenticalaminoacidresiduesinalignedsequences．圖2BmNPVOＲF61的保守結(jié)構(gòu)域(A)及與其他病毒同源蛋白的氨基酸序列比對(B)和系統(tǒng)進(jìn)化分析(C)Fig.2ConservativestructuraldomainofBmNPVOＲF61(A)，alignmentofaminoacidsequencesofOＲF61andhomologousproteinsfromotherviruses(B)andphylogeneticanalysis(C)

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