【摘要】：orf61是桿狀病毒晚期表達的核心基因之一。為了研究家蠶核型多角體病毒(Bm NPV)orf61基因的功能,利用Red重組技術與Bac-to-Bac系統(tǒng)分別敲除和異位補回orf61基因,構(gòu)建了orf61缺失型病毒orf61-ko-Bacmid以及補回型病毒orf61-reBacmid,然后分別轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細胞Bm N,調(diào)查orf61基因缺失對Bm NPV復制和不同時期基因轉(zhuǎn)錄的影響。檢測orf61基因缺失型病毒轉(zhuǎn)染Bm N細胞液上清中的病毒滴度為0,說明orf61基因缺失導致病毒不能形成有感染活性的芽生型病毒粒子(BV);熒光定量PCR分析orf61基因缺失會顯著地降低病毒基因組的復制水平,進而導致病毒各個時期基因轉(zhuǎn)錄水平極顯著下降(P0.01)。此外,通過體外EMSA試驗和構(gòu)建雙熒光素酶報告基因系統(tǒng),檢測ORF61蛋白對多角體蛋白基因polh啟動子的調(diào)控作用,結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)是polh基因轉(zhuǎn)錄的負調(diào)節(jié)因子。研究結(jié)果有助于深入闡釋Bm NPV orf61基因在病毒基因組復制中的作用以及對極晚期表達的多角體蛋白基因polh的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。
【圖文】：

的上、下游引物分別為OＲF61F和OＲF61Ｒ，cat基因擴增的上、下游引物分別為catF和catＲ。用于重組基因擴增的引物組合分別為OＲF61F和OＲF61Ｒ、OＲF61F和catＲ、catF和OＲF61Ｒ。引物序列見表1。1.3.2orf61補回型Bacmid的構(gòu)建根據(jù)orf61基因序列設計補回引物OＲF61reF和OＲF61reＲ，上游引物引入XhoⅠ酶切位點，下游引物引入KpnⅠ酶切位點，，PCＲ產(chǎn)物包含orf61基因上游啟動子序列共242bp。然后把擴增的序列插入轉(zhuǎn)移載體pFast-Bac-HTB中，并利用Bac-to-Bac系統(tǒng)將序列轉(zhuǎn)座至Bacmid，獲得補回型Bacmid，鑒定方法同上。圖1orf61基因缺失型BmNPV病毒(A)和orf61基因補回型BmNPV病毒(B)的構(gòu)建策略示意圖Fig.1Schematicstrategyforconstructionoforf61knockoutBmNPVbacmid(A)andorf61rescuedBmNPVbacmid(B)

源蛋白的序列相似度分別為96%、91%、68%和54%(圖2-B)。利用最大簡約法構(gòu)建的OＲF61蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，BmNPV與AcM-NPV的親源關系較近，而與DekiNPV的親緣關系較遠(圖2-C)。B圖陰影示比對序列中的氨基酸殘基完全一致。Ⅰ—BmNPVOＲF61(NP_047478．1)，Ⅱ—AcMNPVOＲF75(NP_054105．1)，Ⅲ—MaviNPVOＲF58(YP_950788．1)，Ⅳ—ThorMNPVHypothetical(YP_007250482．1)，Ⅴ—CapoNPVOＲF6(YP_009255324．1)，Ⅵ—DekiNPVOＲF79(AFS51957．1)。BackgroundinpanelBindicateidenticalaminoacidresiduesinalignedsequences．圖2BmNPVOＲF61的保守結(jié)構(gòu)域(A)及與其他病毒同源蛋白的氨基酸序列比對(B)和系統(tǒng)進化分析(C)Fig.2ConservativestructuraldomainofBmNPVOＲF61(A)，alignmentofaminoacidsequencesofOＲF61andhomologousproteinsfromotherviruses(B)andphylogeneticanalysis(C)

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