【摘要】：目的:觀察西酞普蘭(citalopram)對3xTgAD小鼠認知功能障礙的改善作用,探討西酞普蘭神經保護作用的可能機制。方法:將5月齡雌性三轉基因(3xTg)阿爾茨海默病(AD)小鼠與野生型小鼠(wild type,WT)隨機分為以下四組:野生型對照組(WT+Water)、野生型治療組(WT+Citalopram)、轉基因對照組(3xTgAD+Water)和轉基因治療組(3xTgAD+Citalopram)。每組小鼠11-12只。從5月齡起在小鼠飲水中加入或不加入藥物西酞普蘭(濃度0.06mg/ml),小鼠經飲水攝入藥物,共持續(xù)3個月。小鼠從7月齡起開始進行行為學實驗:(1)曠場實驗將小鼠置于曠場中央,讓其自由探索5分鐘,記錄小鼠運動距離及中央區(qū)域探索時間;(2)Y迷宮自發(fā)交替實驗將小鼠置于三臂交匯處,自由探索8 min,記錄小鼠進臂的總次數以及每次進臂的順序,計算小鼠進臂正確率;(3)Morris水迷宮實驗分為定位航行試驗和空間探索試驗兩部分,分別記錄小鼠尋找平臺的逃避潛伏期、穿過平臺所在位置的次數;(4)高架十字迷宮實驗將小鼠置于迷宮中,令其自由活動5min,記錄其移動的總距離及在開放臂中停留的時間;(5)懸尾實驗將小鼠尾巴懸掛在鉤上5min,記錄小鼠不動時間。行為學實驗結束后,每組小鼠隨機取6只進行在體海馬長時程增強(LTP)實驗。腹腔水合氯醛麻醉小鼠,將其固定于腦立體定位儀上。在顱骨上鉆孔,將同心圓刺激電極置于海馬Schaffer側枝/聯合纖維通路上,記錄電極置于海馬CA1區(qū)。使用電刺激器及配套的隔離器產生電刺激信號,記錄電極拾取海馬CA1區(qū)放射層興奮性突觸后電位(fEPSPs),經多道生理信號采集處理系統放大。先給予每30秒1次的測試刺激至少15min,以得到穩(wěn)定的基礎性突觸傳遞。然后,使用高頻刺激(HFS)誘導fEPSPs的LTP。HFS之后,繼續(xù)記錄fEPSPs,持續(xù)至少1h。將HFS后的fEPSPs斜率相對基礎水平斜率進行標準化,繪制fEPSPs斜率變化與時間的關系曲線,并計算各組小鼠HFS后0-10min和21-60min的曲線下面積(AUC)。HFS之前進行雙脈沖易化(PPF)實驗,分析突觸前功能變化。電生理實驗結束后,取小鼠海馬及大腦皮層新鮮組織進行分子生物學實驗:(1)ELISA實驗使用ELISA方法測量3xTgAD小鼠海馬及皮層Aβ含量,根據ELISA試劑盒的說明書操作;(2)Western blot實驗使用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉至PVDF膜,使用一抗結合APP、CTFβ及β-actin,二抗結合一抗后用ECL顯色,用Image J分析。實驗使用雙因素方差分析或三因素重復測量方差分析進行多個均數的比較。使用t檢驗比較兩組均數間的差異。P0.05被認為具有統計學意義。結果:(1)曠場實驗:3xTgAD小鼠運動距離小于WT小鼠(P0.001),西酞普蘭可增加WT小鼠的運動距離(P=0.017),但不影響轉基因小鼠的運動距離(P=0.123);3xTgAD小鼠較WT小鼠在曠場中央停時間明顯增多(P=0.009),西酞普蘭對WT(P=0.308)和3xTgAD小鼠(P=0.290)在中央區(qū)的探索時間均無影響。(2)高架十字迷宮實驗:3xTgAD小鼠運動距離小于WT小鼠(P=0.003),西酞普蘭對WT小鼠(P=0.106)與3xTgAD小鼠(P=0.827)的運動距離都無影響;3xTgAD小鼠在開放臂停留時間較WT小鼠明顯延長(P=0.012),但西酞普蘭并未影響WT(P=0.387)與3xTgAD小鼠(P=0.184)在開放臂的停留時間。(3)懸尾實驗:各組小鼠不動時間沒有顯著差異(P0.05)。(4)Y迷宮自發(fā)交替實驗:3xTgAD小鼠的進臂次數少于WT小鼠(P0.001),西酞普蘭不影響WT(P=0.395)及3xTgAD小鼠(P=0.925)的進臂次數;各組小鼠進臂正確率無統計學差異(P0.05)。(5)Morris水迷宮實驗:在定位航行試驗中,各組小鼠的逃避潛伏期隨著訓練天數的增加而縮短(P0.001);在5天訓練過程中,3xTgAD小鼠的逃避潛伏期明顯長于WT小鼠(P0.05),西酞普蘭能明顯縮短3xTgAD小鼠延長的逃避潛伏期(P0.05);在空間探索試驗中,3xTgAD小鼠穿越平臺次數明顯少于WT小鼠(P=0.004),西酞普蘭能顯著增加3xTgAD小鼠穿越平臺次數(P=0.003)。(6)在體海馬LTP記錄:各組小鼠0-10min AUC之間不存在統計學差異(P0.05);3xTgAD小鼠21-60min AUC明顯低于WT小鼠(P=0.010);西酞普蘭治療后3xTgAD小鼠21-60minAUC明顯增加(P=0.047);各組小鼠fEPSP2/fEPSP1比值沒有統計學差異(P0.05)。(7)ELISA實驗:3xTgAD小鼠海馬及皮層組織可溶性Aβ含量由于低于ELISA試劑盒的檢測下限而未得出有意義的結果;轉基因小鼠經西酞普蘭治療后海馬、大腦皮層不溶Aβ_(40)含量顯著低于未治療組(P=0.018,P=0.0348);西酞普蘭治療與否不影響3xTgAD小鼠海馬及大腦皮層不溶Aβ_(42)的含量(P0.05)。(8)Western blot實驗:3xTgAD小鼠海馬組織APP、CTFβ含量高于WT小鼠(P=0.001,P0.001),西酞普蘭能顯著降低3xTgAD小鼠海馬APP、CTFβ水平(P=0.018,P=0.023)。結論:(1)7-8月齡雌性3xTgAD小鼠工作記憶正常,但空間學習記憶能力明顯受到傷害;慢性經口給予西酞普蘭可改善3xTgAD小鼠的空間學習記憶能力。(2)7-8月齡雌性3xTgAD小鼠表現出淡漠樣、去抑制樣行為,西酞普蘭對上述精神行為異常無效;7-8月齡雌性3xTgAD轉基因小鼠未表現出抑郁樣行為;(3)西酞普蘭慢性經口給藥能減輕雌性3xTgAD小鼠海馬CA1區(qū)突觸可塑性傷害;(4)西酞普蘭慢性經口給藥能減少雌性3xTgAD小鼠海馬及皮層組織Aβ含量,這種減少可能是通過下調APP的表達或增強α分泌酶活性而實現的。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R749.16

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