【摘要】：自從1996年第一批遺傳改良農(nóng)作物商業(yè)化種植以來,轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的種植歷史已經(jīng)跨越了整整20個年頭。至今,全球范圍內(nèi)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的累計種植面積已經(jīng)超過20億公頃,各個國家的農(nóng)民因此而獲得的利益累計超過1500億美元。第一代Bt轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物只含有單個的抗蟲基因,經(jīng)過多年的單一化種植后,許多地方出現(xiàn)了抗性害蟲和次要害蟲的爆發(fā);在我國,Bt農(nóng)作物絕大多數(shù)是含有單個Cry1Ac蛋白的抗蟲棉花,近年來已經(jīng)陸續(xù)出現(xiàn)抗性棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)和棉紅鈴蟲(Pectinophoragossypiella)等的發(fā)生。提升害蟲治理的策略、發(fā)展第二代甚至第三代Bt轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的工作迫在眉睫。傳統(tǒng)上,治理害蟲抗性的方法有“高劑量/庇護所”(high-dose/refuge)策略和“基因堆疊”(pyramids)策略。前者注重農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)方法,后者則是提高產(chǎn)品自身的性能�；蚨询B的方法可以是將二個或者二個以上表達單個Bt基因的轉(zhuǎn)化體通過雜交聚合在一個品種中,也可以通過在同一個T-DNA構(gòu)建幾個串聯(lián)的開放閱讀框而實現(xiàn)。但是,這樣獲得的轉(zhuǎn)基因株系中容易出現(xiàn)不同Bt蛋白之間表達量差異大、啟動子的同源沉默等情況。鑒于此,本研究首次設(shè)計并改良了一種Bt基因融合策略,將兩種不同類型的Bt基因整合成一個融合基因,導(dǎo)入到農(nóng)作物玉米和水稻中,使得轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物能夠同時、等量、穩(wěn)定地獲得兩種Bt蛋白的抗蟲能力;同時分別設(shè)計編碼兩種不同長度連接肽的序列,插入到兩個基因的連接處,使得轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物中能夠穩(wěn)定表達完整的、全長的抗蟲融合蛋白。本研究選用了一種Cry蛋白和一種Vip3蛋白,將其核苷酸序列融合;使用的Cry蛋白是商業(yè)化最成熟的Bt殺蟲晶體蛋白之一 Cry1Ab,已經(jīng)成功在玉米、棉花等農(nóng)作物上商業(yè)化生產(chǎn);Vip3蛋白是本課題組自主研發(fā)的高效抗蟲蛋白Vip3da,這是一種Bt營養(yǎng)期殺蟲蛋白;這兩種蛋白的抗性機理是完全不一樣的。本課題組早前在研究過程中發(fā)現(xiàn),這兩個基因直接串聯(lián)轉(zhuǎn)入植物后,轉(zhuǎn)化事件中往往無法檢測到全長的融合蛋白。因此,本研究設(shè)計了兩段連接肽分別用于連接兩個基因:一段是由八個非極性氨基酸組成的短肽linker,另一端是來源于玉米幾丁質(zhì)酶兩個結(jié)構(gòu)域之間的連接序列(Chitinaselinker,CL)。這兩段連接肽都沒有生物活性,只起到連接的作用,用于避免Cry1Ab蛋白與Vip3da蛋白的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生擠壓和拮抗、從而導(dǎo)致融合蛋白的降解;含有短肽linker的融合基因命名為CAL,含有Chitinaselinker的融合基因命名為CACL。對原核表達蛋白的生物活性測定結(jié)果顯示,CAL與CACL蛋白兼具有Cry1Ab蛋白和Vip3da蛋白的活性和殺蟲譜,對Cry1Ab無法殺滅的小地老虎和粘蟲,CAL/CACL具有良好的殺蟲活性。本研究構(gòu)建了具有抗蟲融合基因的T-DNA載體,并以不同的啟動子啟動抗蟲融合基因在玉米和水稻中的表達。研究結(jié)果顯示,具有編碼連接肽序列的融合基因轉(zhuǎn)入玉米和水稻后,轉(zhuǎn)基因植株中可以檢測到完整的、全長的抗蟲融合蛋白,并且植株具有相應(yīng)的抗蟲活性。最終,篩選出了 SL34和SL21這兩個玉米轉(zhuǎn)化株系,以及A1L、SL6和SL14三個水稻轉(zhuǎn)化株系。對這些轉(zhuǎn)化株系進行分子特征的鑒定,并測定了它們的外源蛋白表達量、T-DNA插入位點和拷貝數(shù)等信息,并利用棉鈴蟲、粘蟲和小地老虎等主要的鱗翅目害蟲測定了它們的生物活性,為后續(xù)的商業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù)。
【圖文】：

和Ｂｔ邋１１，杜邦先鋒育種公司（Ｐｉｏｎｅｅｒ邋Ｈｉ－Ｂｒｅｄ邋Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ邋Ｉｎｃ．）的抗甲蟲玉米逡逑ＨｅｒｃｕｌｅｘＴＭ和抗除草劑玉米Ｏｐｔｉｍｕｍ？，等等。在２０年的發(fā)展歷程中，遺傳改良逡逑農(nóng)作物的種植面積始終呈線性增長狀態(tài)（圖１．１），而且自２０１１年開始，發(fā)展中逡逑國家的種植面積逐漸超過發(fā)達國家；截至２０１５年，全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的種植面逡逑積已經(jīng)達到了約１．８億公頃，這一數(shù)字在１９９６年僅為１７０萬公頃，增長面積超逡逑過１００倍，２０年累計種植面積已經(jīng)超過２０億公頃，各個國家的農(nóng)民們因此而獲逡逑得的利益累計超過１５００億美元［４］。遺傳改良農(nóng)作物商業(yè)化種植的成功，不僅給逡逑農(nóng)民們帶去了顯而易見的收益，而且對環(huán)境保護也起到了非常積極的作用，各種逡逑化學(xué)農(nóng)藥的使用量因遺傳改良農(nóng)作物的種植而減少了邋３７％，作物產(chǎn)量卻提高了逡逑２２％［７］0逡逑ＧＬＯＢＡＬ邋ＡＲＥＡ邋ＯＦ邋ＢＩＯＴＥＣＨ邋ＣＲＯＰＳ逡逑Ｍｉｌｌｉｏｎ邋Ｈｅｃｔａｒｅｓ邋（１９９６－２０１５）逡逑Ｔｏｔａｌ邋Ｈｅｃｔａｒｅｓ逡逑２００－Ｑ－Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ邐■邋２８邋Ｂｉｏｔｅｃｈ邋Ｃｒｏｐ邋Ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ逡逑１８0＿邐＾邋Ｄｅｖｅｌｏｐ

邐Ｉ逡逑Ｈ三ｎｒ三三三一邋■一三ｙ丨＝三三－匚三三逡逑＂＂■＝＿—＝邐ｚｊｚ邋二二邋＿————逡逑ＣｙＴ＾ｆｆｉ逡逑ＩＩ邋ＩＩ邐ＩＩ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｌｃｙ？邋��？：邐■邐ｎ邋Ｉ邋Ｉ邋ＩＩ邐ＩＩ邐ｒ￣ｒ￣逡逑圖１．４部分Ｃｒｙ和Ｃｙｔ毒素的殺蟲譜。目前已有幾十種Ｃｒｙ和Ｃｙｔ蛋白被報道具有殺蟲活逡逑性，其中白色表示沒有活性，黑色表示具有殺蟲活性，灰色表示具有部分活性。這些Ｂｔ毒逡逑素是生物抗蟲技術(shù)豐富的資源庫。［１２］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．４邋Ｔｈｅ邋ｓｐｅｃｔｒｕｍ邋ｏｆ邋ａ邋ｐａｒｔ邋ｏｆ邋Ｃｒｙ邋ａｎｄ邋Ｃｙｔ邋ｔｏｘｉｎｓ逡逑１．２．３邋Ｂｔ毒素的分類、命名與多樣性逡逑根據(jù)Ｂｔ毒素命名委員會（Ｂｔ邋Ｔｏｘｉｎ邋Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ邋Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）［２３］的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，，逡逑Ｂｔ毒素家族目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并命名了超過３００種蛋白［１７］，每年都會有新的毒素被逡逑發(fā)現(xiàn)和命名。如何對數(shù)量龐大的毒素進行準確、統(tǒng)一、合理的命名，曾經(jīng)是困擾逡逑科學(xué)家們的一大爭論�，F(xiàn)行的命名體系的分類依據(jù)是氨基酸序列的相似度（同源逡逑性）
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S435.11;S435.13

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 范巧蘭;王慧;李永山;劉凱;賈崢嶸;郝佳麗;席吉龍;張建誠;;轉(zhuǎn)基因玉米對土壤酶活性的影響[J];山西農(nóng)業(yè)科學(xué);2019年01期

2 ;歐盟批準2項轉(zhuǎn)基因玉米用于食品和飼料[J];農(nóng)藥;2019年02期

3 唐世明;開賽爾·買買提明·特肯;古麗仙·阿布都沙的;;轉(zhuǎn)基因玉米的技術(shù)發(fā)展綜述[J];和田師范�？茖W(xué)校學(xué)報;2018年02期

4 張銘;;轉(zhuǎn)基因玉米與帝王蝶事件[J];中小學(xué)實驗與裝備;2017年01期

5 ;長期食用某種轉(zhuǎn)基因玉米可能影響老鼠生育能力[J];成才之路;2008年31期

6 ;越南農(nóng)業(yè)部擬擴大轉(zhuǎn)基因玉米種植面積[J];農(nóng)藥;2017年01期

7 崔寧波;張正巖;張曲薇;;轉(zhuǎn)基因玉米材料的選育及產(chǎn)業(yè)化研究進展[J];河南農(nóng)業(yè)科學(xué);2017年06期

8 石淼;;轉(zhuǎn)基因玉米檢測技術(shù)初論[J];新農(nóng)業(yè);2017年15期

9 澎湃;;歐盟最高法院力挺意大利農(nóng)民 支持轉(zhuǎn)基因玉米的種植[J];農(nóng)藥市場信息;2017年26期

10 劉松松;;孟山都公司承認:轉(zhuǎn)基因玉米會污染墨西哥傳統(tǒng)玉米[J];農(nóng)藥市場信息;2016年02期

相關(guān)會議論文 前10條

1 付鳳玲;李晚忱;;抗凍轉(zhuǎn)基因玉米培育[A];第一屆全國玉米生物學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2015年

2 韓庚辰;;我國轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化的機遇與挑戰(zhàn)[A];創(chuàng)新生物經(jīng)濟環(huán)境，培育戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)——第四屆中國生物產(chǎn)業(yè)大會·2010海峽兩岸重大生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化論壇會刊[C];2010年

3 王悅冰;郎志宏;黃大f ;;利用瞬時表達體系檢測不同內(nèi)含子在轉(zhuǎn)基因玉米中的增強效應(yīng)[A];中國農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)會第三屆會員代表大會暨學(xué)術(shù)交流會論文摘要集[C];2006年

4 袁鷹;劉德璞;鄭培和;郝文媛;;玉米遺傳轉(zhuǎn)化研究進展[A];“振興吉林老工業(yè)基地——科技工作者的歷史責任”吉林省第三屆科學(xué)技術(shù)學(xué)術(shù)年會論文集（下）[C];2004年

5 張士龍;賀正華;黃益勤;;抗蟲、耐漬轉(zhuǎn)基因玉米種質(zhì)的創(chuàng)制[A];2012年全國玉米遺傳育種學(xué)術(shù)研討會暨新品種展示觀摩會論文及摘要集[C];2012年

6 陳威;王坤;王學(xué)永;劉麗;番興明;;高賴氨酸轉(zhuǎn)基因玉米的鑒定和檢測[A];2012年全國玉米遺傳育種學(xué)術(shù)研討會暨新品種展示觀摩會論文及摘要集[C];2012年

7 劉小紅;張紅偉;劉昕;劉欣潔;譚振波;榮廷昭;;MDMV CP基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因玉米的研究[A];2004全國玉米種質(zhì)擴增、改良、創(chuàng)新與分子育種學(xué)術(shù)會議論文集[C];2004年

8 胡桂學(xué);王龍濤;高雯雯;付永平;王丕武;;豬傳染性胃腸炎病毒纖突蛋白基因基因槍法轉(zhuǎn)基因玉米[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2010年學(xué)術(shù)年會——第二屆中國獸醫(yī)臨床大會論文集(上冊)[C];2010年

9 張紅偉;張紅梅;鄭祖平;陳剛;王國英;譚振波;;Bt轉(zhuǎn)基因玉米的獲得及其對玉米螟的抗性分析[A];2003年全國作物遺傳育種學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2003年

10 胡繼超;胡凝;江曉東;陳萬隆;姚克敏;賈士榮;;轉(zhuǎn)基因玉米的基因飄流模型及東北春玉米區(qū)安全風(fēng)險評估[A];第28屆中國氣象學(xué)會年會——S11氣象與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)[C];2011年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 “新華視點”記者 董峻 周琳;中國拒收美國轉(zhuǎn)基因玉米引發(fā)關(guān)注[N];中國青年報;2014年

2 本報記者 李艷潔;中國工程院院士：科研人員已做好轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化準備[N];中國經(jīng)營報;2018年

3 方舟子;轉(zhuǎn)基因玉米更有益健康[N];中國青年報;2010年

4 本報記者 馬愛平;他們?yōu)樯锻捣N轉(zhuǎn)基因玉米[N];科技日報;2018年

5 謝涓;中國首個轉(zhuǎn)基因玉米種子產(chǎn)品將賣給美國[N];中國食品報;2015年

6 蕭何;中國批準轉(zhuǎn)基因玉米進口美國副產(chǎn)品受益[N];新農(nóng)村商報;2014年

7 撰稿 本報記者 劉葉琳;轉(zhuǎn)基因玉米：福兮禍兮？[N];國際商報;2015年

8 記者 梁曉華;法國和歐盟就轉(zhuǎn)基因玉米再度較量[N];光明日報;2014年

9 本報駐巴黎記者 梁曉華;法國立法禁止轉(zhuǎn)基因玉米種植[N];光明日報;2014年

10 新金融記者 彭俊勇;轉(zhuǎn)基因玉米退運背后[N];新金融觀察;2014年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 許超;一種Bt基因融合策略在治理害蟲對轉(zhuǎn)基因玉米和水稻抗性中的應(yīng)用[D];浙江大學(xué);2018年

2 白云鳳;利用不同策略獲得抗SCMV轉(zhuǎn)基因玉米的研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

3 馬金霞;非編碼基因zm401對玉米小孢子發(fā)育的影響[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

4 路興波;轉(zhuǎn)基因玉米環(huán)境安全性及其產(chǎn)品成分檢測技術(shù)[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

5 劉成;玉米抗旱基因資源的鑒定與評價研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

6 高春起;轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米在蛋雞上的飼用安全性和有效性評價[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

7 李京;新型轉(zhuǎn)基因抗草甘膦玉米的培育及轉(zhuǎn)基因玉米安全控制技術(shù)的研究[D];浙江大學(xué);2013年

8 王柏鳳;轉(zhuǎn)基因玉米對跳蟲的影響[D];中國科學(xué)院研究生院（東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所）;2014年

9 張淑娟;利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造適合纖維素乙醇生產(chǎn)的玉米新材料[D];山東大學(xué);2011年

10 Hussain Javed Umrani;ABP9過表達轉(zhuǎn)基因玉米在大田中的抗旱表現(xiàn)[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 詹騰飛;富維生素E轉(zhuǎn)基因玉米對肉雞生產(chǎn)性能、免疫和抗氧化功能的影響[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2019年

2 姜韜;三種轉(zhuǎn)基因玉米對害蟲天敵種群動態(tài)及生長發(fā)育的影響[D];揚州大學(xué);2018年

3 張曉婧;一種抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米的分子特征和遺傳穩(wěn)定性檢測[D];浙江大學(xué);2017年

4 高燕;抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米ZD12-6的目的性狀和功能性評價[D];浙江大學(xué);2017年

5 劉苗苗;轉(zhuǎn)G10evo和ZmTE1基因抗草甘膦高產(chǎn)玉米的研究[D];浙江大學(xué);2017年

6 郭夢凡;轉(zhuǎn)Cry1Ab和epsps基因玉米的大鼠三代生殖毒性和子代神經(jīng)發(fā)育毒性評價[D];中國疾病預(yù)防控制中心;2018年

7 丁風(fēng)鵝;海洋微生物CSP基因提高轉(zhuǎn)基因玉米的抗旱和耐寒性[D];大連理工大學(xué);2018年

8 張正巖;中國轉(zhuǎn)基因玉米技術(shù)商業(yè)化的風(fēng)險預(yù)判研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

9 翟新秘;利用基因清除技術(shù)創(chuàng)制安全轉(zhuǎn)基因玉米的研究[D];貴州大學(xué);2018年

10 趙方方;抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米吉抗309的環(huán)境安全評價和營養(yǎng)成分分析[D];哈爾濱師范大學(xué);2018年

本文編號：2664872