發(fā)布時間：2020-05-13 10:48

【摘要】：工作目的:探究Tbx3基因在小鼠胚胎干細胞中表達的表觀遺傳學調控。研究方法:1、首先,通過RT-qPCR實驗,檢測DPF2敲除細胞中Tbx3基因的表達,確定DPF2對Tbx3的調控情況。然后,通過CHIP-seq和熒光素酶實驗(luciferase Assay)找到小鼠胚胎干細胞中Tbx3基因的潛在增強子位點;其次,運用CRISPR/Cas9基因編輯技術,對Tbx3基因Enhancer-2、Enhancer-3-6和Enhancer-7位點進行敲除,檢測對Tbx3表達的調控情況;最后,對DPF2敲除細胞進行CHIP-seq分析,研究驗證DPF2對Tbx3的調控位點以及調控機制;2、首先,通過DPF2敲除細胞的CHIP-seq實驗,發(fā)現(xiàn)Tbx3基因Enhancer-2位點存在PRC2介導的H3K27me3修飾;其次,為驗證PRC2對Tbx3表達的調控作用,構建小鼠EED基因條件性敲除的ES細胞;最后,進行EED敲除細胞的CHIP-Seq分析,分析干性相關蛋白Oct4和Sox2在Enhancer-2位點的變化。結果:1、小鼠ES細胞DPF2敲除顯著降低了Tbx3基因的表達;2、Enhancer-7位點敲除顯著降低了Tbx3基因在小鼠ES細胞的表達;3、DPF2敲除,Tbx3基因的Enhancer-7位點H3K27Ac和干性相關轉錄因子OCT4的結合能力減弱;4、Enhancer-2位點敲除并未影響Tbx3基因在小鼠ES細胞的表達;5、EED敲除顯著升高了Tbx3基因在小鼠ES細胞的表達;6、EED敲除,Tbx3基因Enhancer-2位點H3K27me3修飾減弱,干性相關轉錄因子Oct4和Sox2的結合增加。結論:綜上所述,在小鼠胚胎干細胞中,Tbx3基因存在兩個特異的增強子Enhancer-7和Enhancer-2,分別受染色質重塑因子DPF2和PRC2調控。DPF2通過影響Enhancer-7區(qū)域的H3K27Ac修飾以及Oct4蛋白在Enhancer-7上的結合,從而正向調控Tbx3基因的表達;PRC2通過調控Tbx3 Enhancer-2的H3K27me3修飾,進而調控Oct4、Sox2等在Enhancer-2的結合,從而對Tbx3基因的表達起到抑制作用。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q756

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