【摘要】：紅苞鳳梨(Ananas comosus var.bracteatus)由于其葉片嵌合形狀多樣且明顯,成為一種重要的新型觀賞植物。嵌合性狀在組織培養(yǎng)過程中很不穩(wěn)定,再生植株中嵌合型植株數(shù)量稀少。探究葉色鑲嵌的形成機(jī)理,對提高繁育過程中嵌合性狀的穩(wěn)定性有著重要的意義。本文通過組織培養(yǎng)得到嵌合性狀分離的全白植株和全綠植株,通過分析兩種植株光合色素合成相關(guān)生理指標(biāo)和基因表達(dá)的差異,篩選出導(dǎo)致葉片白化的關(guān)鍵基因為POR基因。通過建立VIGS基因沉默體系,得到一種快速獲得轉(zhuǎn)基因植株鑒定基因功能方法。并對POR基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)分析和功能驗證,探究其對紅苞鳳梨葉片白化的影響,為深入分析紅苞鳳梨白化細(xì)胞失綠突變的分子機(jī)理提供理論依據(jù),對提高紅苞鳳梨嵌合性狀的穩(wěn)定性,促進(jìn)紅苞鳳梨的工廠化育苗具有重要的實踐意義。獲得的主要研究結(jié)果如下:1通過對EF1、UBQ、ACT、GADPH、Histone、TUA、TUB、18S、elf-5A、α-tubulin10個候選基因在紅苞鳳梨不同生長階段、全綠和全白葉樣品中進(jìn)行RT-q PCR表達(dá)模式分析,篩選出紅苞鳳梨不同生長發(fā)育時期最適內(nèi)參基因是Histone和α-tubulin,18s、EF1和α-tubulin的內(nèi)參組合在全綠苗和全白苗的對比分析時最理想。采用Pet F基因驗證篩選結(jié)果,證明所選的內(nèi)參基因合適。2以紅苞鳳梨全綠植株和全白植株葉片為材料,通過RNA-seq測序,經(jīng)COG、GO和KEGG功能注釋分析,發(fā)現(xiàn)DEGs主要在葉綠體發(fā)育、葉綠素合成和光合作用途徑富集。而葉綠素合成代謝過程中有13個差異表達(dá)基因,RNA-seq和Real time q PCR分析表明,13個DEGs中僅2個POR基因在全白植株中下調(diào)表達(dá)。POR基因可能是紅苞鳳梨葉片白化細(xì)胞失綠突變的關(guān)鍵基因。3測定了紅苞鳳梨組培全白和全綠植株的葉綠素合成中間代謝產(chǎn)物及葉綠素的含量。全綠葉片中Pchlide的含量是全白葉片的4倍,經(jīng)原葉綠素酸酯氧化還原酶(POR)的催化,全綠葉片中Chla的含量是全白葉片的30倍。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行分析,推測POR基因可能是關(guān)鍵基因,POR基因編碼的原葉綠素酸酯氧化還原酶抑制可能是導(dǎo)致是細(xì)胞失綠白化的關(guān)鍵原因。4克隆得到2個POR基因的c DNA序列,分別命名為POR1和POR2,兩個基因的ORF序列長度分別為1167bp和1218bp,分別編碼388和405個氨基酸。導(dǎo)入NCBI進(jìn)行Blast比對,確定兩個基因均是POR基因,屬于短鏈脫氫酶(c-like SDR)家族。這兩條核苷酸序列的同源性為73.81%,由堿基推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為74.08%。將氨基酸序列與39個不同植物的不同類型POR基因的氨基酸序列進(jìn)行比對,并建立系統(tǒng)進(jìn)化樹,推測POR1可能為紅苞鳳梨的PORB基因,POR2為紅苞鳳梨的PORA基因。5選取PDS基因作為指示基因,使用煙草脆裂病毒為載體,在紅苞鳳梨中建立VIGS基因沉默體系。構(gòu)建基因沉默載體PDS-TRV2,利用農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)將沉默載體PDS-TRV2和TRV2空載注射紅苞鳳梨全綠苗。經(jīng)PCR檢測確定病毒在植物內(nèi)復(fù)制并轉(zhuǎn)移,對沉默后的紅苞鳳梨葉色進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)沉默載體的紅苞鳳梨(Si)和轉(zhuǎn)沉默載體的隔葉(Si-Ge)葉色輕微偏黃,對基因沉默的紅苞鳳梨類胡蘿卜素含量分析表明,Si組和Si-Ge組紅苞鳳梨類胡蘿卜素含量低于陰性對照組(CK)和陽性對照組(P),說明成功構(gòu)建紅苞鳳梨VIGS體系。6使用構(gòu)建成功的VIGS體系,分別選取POR1、POR2中各230bp和298bp保守序列,分別構(gòu)建沉默載體POR1-TRV2和POR2-TRV2,利用農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)將兩個POR基因沉默載體和TRV2空載注射紅苞鳳梨全綠苗。RT-q PCR檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)沉默載體的紅苞鳳梨(Ti)POR基因表達(dá)量低于陰性對照組(CK)和陽性對照組(P)。對沉默后的紅苞鳳梨葉色進(jìn)行比對,Ti1組和Ti1-Ge組紅苞鳳梨葉色總體偏黃,且Ti1組和Ti1-Ge組葉綠素含量相較兩個對照組下降30%,說明Ti1組葉綠素合成受阻;Ti2組和Ti2-Ge組紅苞鳳梨葉色與兩個對照組相近,且Ti2組和Ti2-Ge組葉綠素含量與兩個對照組差異不顯著,說明Ti2組葉綠素合成未受太大影響。推測POR1基因可能在葉片葉綠素合成過程中發(fā)揮較重要的作用。
【圖文】：

尤其在植物綠色果皮和葉片中含量極高，在植物進(jìn)行光合作用時發(fā)揮著重要的作用[41]。葉綠素的合成經(jīng)過一系列復(fù)雜的酶促生化反應(yīng)（圖 1-1），簡單來講是由 L-谷氨酸-tRNA 經(jīng)過多步反應(yīng)形成葉綠素 a，最終氧化形成葉綠素 b[42]，有15個酶參與葉綠素生物合成的15步反應(yīng)，共27個基因來調(diào)控這些酶的合成[43]（表 1-1），目前，這 27 個基因基本可以在擬南芥[44]、煙草[45]、大豆[46]、大麥[45]和豌豆[47]等植物中分離出來。葉綠素生物合成中的每一個環(huán)節(jié)都至關(guān)重要，某個基因發(fā)生突變或某個環(huán)節(jié)出現(xiàn)差錯，都會影響葉綠素的合成[48]。計瑋瑋研究吊蘭葉綠素合成過程發(fā)現(xiàn)，糞卟啉Ⅲ合成 Mg-原卟啉 IX 受阻，致使葉片白化且該部分葉綠素 a 含量顯著低于正常綠色部分[49]；Liu 等發(fā)現(xiàn)水稻黃化葉片葉綠素含量降低，是由于 HEMA 基因的突變，影響谷氨酰-1-半醛合成，而產(chǎn)生黃化[50]；劉彩云所研究的白肋型煙草，在葉綠素合成過程中受阻于糞卟啉Ⅲ和原卟啉 IX 之間，導(dǎo)致該型煙草與正常綠色煙草不同[51]。

圖 1-2 病毒誘導(dǎo)基因沉默機(jī)制[62]Fig1-2 The mechanism of VIGS[62] 影響 VIGS 的因素1 寄主因素一病毒的侵染和移動效率對不同植物或者同一種植物的不同品種均不。由于每一種病毒有一定的寄主范圍，寄主植物的不同需要開發(fā)的病毒載。Holzberg 利用大麥條紋花葉病毒（Barley stripe mosaic virus，BSMV，首次成功抑制單子葉植物大麥的 PDS 基因，在小麥上也得到應(yīng)用[63]明，本生煙（N.benthamiama）成為一種模式植物，是由于很多病毒可內(nèi)高水平積累并轉(zhuǎn)移，深入探索發(fā)現(xiàn)本生煙中 RDR1 基因發(fā)生突變，該變導(dǎo)致抗病毒功能減弱，并且本生煙中缺少一種水楊酸，，這些可能使得
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S682.36

【相似文獻(xiàn)】

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1 李瑞雪;紅苞鳳梨VIGS基因沉默體系的建立及POR基因的克隆與功能驗證[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

本文編號：2659816