【摘要】：植物的開花過程與種群的延續(xù)直接相關(guān),精確的開花時間是植物成功繁殖的關(guān)鍵。擬南芥的開花過程主要由光周期途徑、春化途徑、自主途徑、赤霉素途徑和年齡途徑等調(diào)控,其中,春化是指經(jīng)過冷處理使植物獲得或者加速成花的轉(zhuǎn)化的過程。多年生植物通過芽休眠的方式越冬,來年重新進(jìn)入營養(yǎng)生長和生殖生長周期。春化與休眠過程均需要受冷刺激,并且兩個過程都受表觀遺傳調(diào)控,可能具有相似的調(diào)控機(jī)制。桑樹為多年生木本開花植物,廣泛分布于亞洲、歐洲、非洲、美國北部和南部地區(qū)。桑葉用于家蠶的喂養(yǎng),桑果則可直接食用或入藥,具有較高的藥用和保健價值。桑果的果期短,且不易保鮮,因此,早熟或晚熟品種的育成成為果桑育種的重要方向。桑果的早熟和晚熟與桑樹休眠打破的時間密切相關(guān)。MADS-box蛋白是真核生物中的一類轉(zhuǎn)錄因子,該家族基因幾乎參與了植物整個生長發(fā)育過程,其中包括對休眠的調(diào)控。本研究首先從全基因組水平搜查開花相關(guān)基因,對MADS-box基因進(jìn)行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析。利用實時熒光定量PCR,對桑樹中MADS-box基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析,結(jié)果表明,MaMADS33(FLC-like)基因在內(nèi)休眠過程中表達(dá)量較高,內(nèi)休眠解除過程中其表達(dá)量降低,表明桑樹MaMADS33基因可能與內(nèi)休眠過程相關(guān)。我們分別借助異源過表達(dá)、亞細(xì)胞定位、雙分子熒光互補(bǔ)、酵母雙雜交、雙熒光素酶報告系統(tǒng),對桑樹休眠相關(guān)MADS-box基因進(jìn)行研究,主要結(jié)果如下:1、桑樹開花相關(guān)基因的鑒定及桑樹MADS-box基因生物信息分析通過川桑(Morus notabilis L.)全基因組搜索,總共獲得了241個開花相關(guān)基因,包含了開花整合因子、光周期途徑、春化途徑、GA途徑、自主途徑和年齡途徑的關(guān)鍵基因。我們鑒定到8個FT/TFL1同源基因,進(jìn)化分析表明,FT/TFL1家族基因總共分為四個大支,分別是TFL1,BFT,FT以及MFT。擬南芥中有5個紅/遠(yuǎn)紅光受體光敏色素基因,桑樹基因組中僅鑒定到3個紅/遠(yuǎn)紅光受體光敏色素同源基因,根據(jù)序列相似性,分別將其歸類于PHYA、PHYB和PHYE。此外,我們沒有鑒定到依賴于FRI途徑中的FRI直系同源基因,但找到13個FRL同源基因,其中8個FRL基因串聯(lián)重復(fù)的分布于同一scaffold上。借助生物信息學(xué)方法,我們在川桑基因組中總共鑒定到54個MADS-box家族基因,分別命名為MnMADS1-54。進(jìn)化分析表明,54個MnMADS基因包含17個type I基因和37個type II基因。17個type I基因進(jìn)一步分為11個Mα基因,2個Mβ基因和4個Mγ基因;37個type II基因進(jìn)一步分為14個亞家族,分別為AGL2,AGL6,SQUA,AG,FLC,AGl12,TM3,AGL17,STMADS11,AGL15,GLO,DEF,GGM13,MIKC*,其中包含3個FLC-like基因(MnMADS7,MnMADS33,MnMADS50)和4個AGL24/SVP-like基因(MnMADS1,MnMADS42,MnMADS43,MnMADS4)。從基因在scaffold上的分布來看,54個MnMADS基因分布于42個scaffold上,其中10個scaffold上存在基因串聯(lián)重復(fù)分布。串聯(lián)重復(fù)序列中包含1對AGL6-SOC1基因和3對SEP-AP1基因,此外,PI、SVP同源基因以及3組Mα基因存在同源基因復(fù)制現(xiàn)象。選擇壓力分析表明,串聯(lián)重復(fù)的Mα亞家族基因在進(jìn)化過程中受到正選擇壓力作用。蛋白和基因結(jié)構(gòu)分析表明,54個MADS-box蛋白均含有一個MADS結(jié)構(gòu)域,且大多數(shù)type II蛋白具有典型的MIKC結(jié)構(gòu),同一亞家族基因的基因結(jié)構(gòu)相似,type I蛋白幾乎由1個外顯子編碼,type II型中MICK蛋白則由6個左右的外顯子編碼。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及熒光定量分析結(jié)果表明,ABCDE型基因在花器官組織中表達(dá)量較高,暗示了桑樹ABCDE型基因在進(jìn)化過程中結(jié)構(gòu)和功能的保守性。MaMADS33基因在內(nèi)休眠時表達(dá)量較高,內(nèi)休眠解除時期其表達(dá)量降低,暗示其參與內(nèi)休眠過程。2、桑樹AGL24/SVP-like基因功能分析DAM基因為擬南芥AGL24/SVP的同源基因,研究表明,DAM基因參與了多年生植物的休眠過程。我們從桑樹資源金墻63(JQ63,Morus alba)中克隆了4個AGL24/SVP-like基因,分別命名為MaMADS1,MaMADS42,MaMADS43,和MaMADS4。通過多物種同源序列進(jìn)化分析,結(jié)果表明,MaMADS1和MaMADS4分別與擬南芥中的SVP和AGL24基因親緣關(guān)系更近。MaMADS42和MaMADS43與乳漿草(Euphorbia esula L.)中的DAM基因聚為一支,所組成的支系與馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)中的StMADS11聚為一個大枝。在煙草葉片細(xì)胞中瞬時表達(dá)桑樹AGL24/SVP-like-GFP融合蛋白,結(jié)果表明,MaMADS4,MaMADS42和MaMADS43均定位于細(xì)胞核中,MaMADS1除了在細(xì)胞核外,在細(xì)胞膜以及細(xì)胞質(zhì)中也能檢測到熒光信號。擬南芥中過表達(dá)桑樹AGL24/SVP-like基因,結(jié)果表明,過表達(dá)MaMADS4基因的擬南芥顯著提前開花;過表達(dá)MaMADS1則顯著延遲開花,并且其花器官發(fā)育異常。通過酵母雙雜交檢測MaMADS1蛋白與桑樹和擬南芥中花器官發(fā)育相關(guān)的A、B和E型蛋白互作,同時驗證了MaMADS1與桑樹和擬南芥成花相關(guān)蛋白的互作關(guān)系。結(jié)果表明,MaMADS1能夠與擬南芥B和E型蛋白互作,尤其與E型蛋白相互作用更強(qiáng),MaMADS1能夠與桑樹A、B和E型蛋白均相互作用;MaMADS1能夠與擬南芥和桑樹中的成花相關(guān)蛋白FLC、SOC1和AGL24/SVP相互作用,MaMADS1自身還可形成同源二聚體。以上結(jié)果暗示了桑樹MaMADS1基因在花器官的發(fā)育及成花轉(zhuǎn)化中功能的保守性。熒光定量分析結(jié)果表明,MaMADS1在一年生皮、成熟葉、頂芽、成熟葉柄以及苞葉中的表達(dá)量相對較高,尤其在成熟葉柄和苞葉中最高。MaMADS42和MaMADS43的表達(dá)模式極其相似,均在一年生皮以及成熟葉中表達(dá)量較高。MaMADS4基因的表達(dá)與MaMADS1類似,在一年生皮、成熟葉柄、成熟葉以及苞葉中表達(dá)相對較高,在其他組織中表達(dá)較低,與MaMADS1相比,MaMADS4在頂芽中的表達(dá)相對較低。在一周年的花芽中的表達(dá)模式分析表明,桑樹AGL24/SVP-like基因的表達(dá)模式趨于一致,在七月份達(dá)到最高峰,隨后逐漸下降,暗示了桑樹AGL24/SVP-like基因參與了類休眠的過程。3、桑樹FLC-like基因的功能分析我們在桑樹JQ63中克隆了3個FLC-like基因,分別命名為MaMADS33,MaMADS50和MaMADS7。序列分析表明,MaMADS33和MaMADS50均含有較完整的MIKC結(jié)構(gòu),MaMADS7蛋白的C端保守度較低,此外,MaMADS33蛋白的MADS結(jié)構(gòu)域的前端還包含一段由31個氨基酸組成的序列。我們用多個物種的總共84條FLC同源蛋白序列重構(gòu)進(jìn)化樹,結(jié)果表明,MaMADS33/50/7聚為一支,且與酸漿屬(Mimulus)等FLC同源蛋白親緣關(guān)系更近。在煙草葉片細(xì)胞中瞬時表達(dá)桑樹FLC-like-GFP融合蛋白,結(jié)果表明MaMADS7和MaMADS50均定位于細(xì)胞核中,MaMADS33主要定位于細(xì)胞核中,在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中也能檢測到信號。在擬南芥中過表達(dá)桑樹FLC-like基因,結(jié)果表明,與野生型相比,三個基因過表達(dá)株系均一定程度延遲開花,且在過表達(dá)株系中,擬南芥的FT和SOC1基因均被下調(diào)表達(dá)。暗示了桑樹FLC-like基因在開花調(diào)控過程中起抑制作用,與擬南芥FLC基因?qū)﹂_花的調(diào)控相似。本研究中,我們在桑樹MaFT基因的啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)4個CArG盒。借助雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證桑樹FLC-like對MaFT基因啟動子的調(diào)控,結(jié)果表明,MaMADS33、50和7均能夠直接或者間接地結(jié)合MaFT啟動子區(qū)域,并顯著地抑制其下游報告基因的表達(dá)。在一周年的花芽中的表達(dá)模式分析表明,MaMADS33基因在4月到9月期間表達(dá)呈上下波動,11月時表達(dá)出現(xiàn)峰值,其表達(dá)量隨后逐漸降低,到2月和3月時降到最低。MaMAD50則在9月表達(dá)量最高,進(jìn)入11月后,其表達(dá)量也相對降低。MaMADS7基因則在5月時表達(dá)量最高,其余時期呈現(xiàn)波動。MaFT基因在6到10月的表達(dá)量均較高,11月時表達(dá)量急劇降低,隨后在2月和3月時表達(dá)量有所回升。在內(nèi)休眠周期中,MaMADS33與MaFT基因呈相反的表達(dá)模式,并且與內(nèi)休眠過程相關(guān)。MaMADS33基因在冷處理10天時,表達(dá)量出現(xiàn)峰值,隨后表達(dá)量降低,與MaFT基因的表達(dá)模式相反。用脫落酸處理花芽,MaMADS33和MaFT基因的表達(dá)量上升,MaMADS33隨著處理時間增加,其表達(dá)量持續(xù)增加,而MaFT的表達(dá)則逐漸降低。結(jié)合雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗結(jié)果,進(jìn)一步暗示MaMADS33通過抑制MaFT基因的表達(dá)參與內(nèi)休眠過程。我們在不同需冷量的桑樹資源中觀察MaMADS33基因的表達(dá),結(jié)果表明,需冷量與MaMADS33基因的表達(dá)量呈正相關(guān)。為了進(jìn)一步驗證MaMADS33基因的功能,我們構(gòu)建了桑樹酵母雙雜交文庫,用MaMADS33蛋白作為誘餌,篩選到20個陽性克隆,其中包含了MaWAP18蛋白。研究表明,MaWAP18編碼了冬季積累蛋白,MaWAP18基因在內(nèi)休眠時期的mRNA和蛋白水平均較高。我們克隆了MaWAP18的全長,將誘餌蛋白和目的蛋白交換驗證,結(jié)果表明,MaMADS33和MaWAP18蛋白在酵母雙雜交系統(tǒng)中相互作用。通過雙分子熒光互補(bǔ)實驗進(jìn)一步驗證兩個蛋白的互作關(guān)系,結(jié)果表明,在保衛(wèi)細(xì)胞中的熒光信號最強(qiáng)。綜合上文休眠相關(guān)MADS-box基因功能研究結(jié)果,我們認(rèn)為桑樹中DAM-like基因可能參與類休眠過程;FLC同源基因MaMADS33能夠響應(yīng)低溫,在內(nèi)休眠解除時表達(dá)降低,且在內(nèi)休眠過程中與MaFT基因具有相反的表達(dá)模式,此外,MaMADS33能夠與冬季積累蛋白MaWAP18相互做用。本研究結(jié)果為FLC同源基因參與內(nèi)休眠過程提供了新的數(shù)據(jù),并且支持春化途徑和內(nèi)休眠過程具有相似的調(diào)控途徑的推測。
【圖文】：

第一章 文獻(xiàn)綜述第一章 文獻(xiàn)綜述1.1 植物開花調(diào)控機(jī)制開花是植物由營養(yǎng)生長向生殖生長過程轉(zhuǎn)變的標(biāo)志，是通過整合環(huán)境因素和內(nèi)源性信號共同調(diào)控而實現(xiàn)。精確的開花時間是植物生長繁殖和物種進(jìn)化的關(guān)鍵在擬南芥中，至少有六個通路調(diào)控成花轉(zhuǎn)變過程，分別是光周期途徑（Photoperipathway），自主途徑（Autonomous pathway），春化途徑（Vernalization pathway年齡途徑（Age pathway），赤霉素途徑（Gibberellins pathway），以及環(huán)境溫度途（Ambient temperature pathway）[1]。這些通路彼此相互獨(dú)立，又相互影響，形成反饋的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如圖 1.1 所示。

第一章 文獻(xiàn)綜述的兩個 CO 響應(yīng)元件（CORE）進(jìn)而啟動 FT 轉(zhuǎn)錄[24]，另外，F(xiàn)T 啟動子區(qū)域相互依賴的調(diào)控區(qū)域?qū)鬟_(dá)光周期非常重要[25]。.2 春化途徑春化（vernalization）被學(xué)者定義為通過冷處理使植物獲得或者加速成花能力[26]。FLOWERING LOCUS C（FLC）基因由 7 個外顯子組成，基因內(nèi)個內(nèi)含子序列較長，該基因編碼含有 MADS 結(jié)構(gòu)域的抑制開花的轉(zhuǎn)錄因子南芥中為開花過程的強(qiáng)抑制因子，F(xiàn)LC 基因是春化途徑的關(guān)鍵基因，，春化即為沉默 FLC 基因的過程[27]。春化過程對 FLC 的調(diào)控總共分為三個階段：，F(xiàn)LC 的激活，達(dá)到建立春化作用的條件，春化過程中，F(xiàn)LC 表達(dá)降低，色體的構(gòu)象改變，春化后，成花轉(zhuǎn)化之前，表觀遺傳及 VERNALIZATSENSITIVE 3（VIN3）基因的高表達(dá)使得 FLC 維持沉默狀態(tài)[27-28]，如圖 1.
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2;S888.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張俊芳;徐立;李志英;;蜻蜓鳳梨花發(fā)育相關(guān)B類MADS-box基因克隆及表達(dá)分析[J];西北植物學(xué)報;2012年05期

2 郭余龍;;矮牽牛MADS-box基因[J];園藝學(xué)報;2008年06期

3 徐啟江;關(guān)錄飛;吳笑女;孫麗;譚文勃;聶玉哲;李玉花;;草原龍膽MADS-box基因的克隆及表達(dá)分析[J];植物學(xué)通報;2008年04期

4 向林;秦德輝;李小白;李伯鈞;郭方其;吳超;孫崇波;;蕙蘭B類MADS-box基因的克隆及表達(dá)分析[J];園藝學(xué)報;2011年12期

5 林苗苗;趙長竹;顧紅;張慧琴;陳錦永;謝鳴;方金豹;;甜櫻桃B類MADS-box基因的分離與序列分析[J];果樹學(xué)報;2011年06期

6 尹為治;宋珂;高武軍;鄧傳良;姬艷克;盧龍斗;;雌雄異株植物MADS-box基因密碼子偏好性分析[J];河南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2009年02期

7 高志民;陳段芬;李雪平;蔡春菊;彭鎮(zhèn)華;;一個中國水仙MADS-box基因的克隆與分析[J];園藝學(xué)報;2008年02期

8 鞠玉棟;鄭回勇;吳維堅;陳永快;何炎森;吳松海;;中國水仙MADS-box基因克隆及其序列分析[J];安徽農(nóng)學(xué)通報;2008年21期

9 吳雨;;影響水稻花發(fā)育的MADS-box基因研究進(jìn)展[J];科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新;2018年08期

10 邱文明;徐育海;何秀娟;;板栗雌雄花發(fā)育相關(guān)的MADS-box基因發(fā)掘與表達(dá)分析[J];園藝學(xué)報;2016年08期

相關(guān)會議論文 前10條

1 曲曉艷;余剛;李桂華;劉金亮;張祥輝;張艷華;潘洪玉;;核盤菌MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的克隆及RNAi載體的構(gòu)建[A];中國植物病理學(xué)會2012年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2012年

2 羅偉;楊宇杰;馬建;魏育明;鄭有良;蘭秀錦;;基于全基因組鑒定與分析普通小麥MADS-box基因家族[A];第八屆全國小麥基因組學(xué)及分子育種大會摘要集[C];2017年

3 高之楨;陳銳;詹樹萱;孫崇榮;曹凱鳴;;水稻中一個與花發(fā)育相關(guān)的MADS-box基因的表達(dá)檢測[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第八屆會員代表大會暨全國學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2001年

4 宋平;楊倩;張陽;康振生;郭軍;;小麥條銹菌MADS-box轉(zhuǎn)錄因子PsMcm1的鑒定及功能分析[A];中國植物病理學(xué)會2015年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2015年

5 梁允寬;李全梓;張憲省;白書農(nóng);許智宏;;黃瓜中胚珠特異性MADS-box基因的克隆[A];全國植物分子生物學(xué)與生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2000年

6 張君誠;蔡寧波;劉思衡;李毓;莊偉建;;鈣影響花生胚胎發(fā)育的MADS-box基因的克隆與初步鑒定[A];中國遺傳學(xué)會植物遺傳和基因組學(xué)專業(yè)委員會2007年學(xué)術(shù)研討會摘要集[C];2007年

7 孫清萍;汪莉;易平;朱英國;;紅蓮型水稻不育系統(tǒng)花粉發(fā)育不同時期MADS-box基因家族的表達(dá)分析[A];中國的遺傳學(xué)研究——中國遺傳學(xué)會第七次代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編[C];2003年

8 張妙青;張吉宇;劉志鵬;王彥榮;張磊;;垂穗披堿草MADS-box基因WM8克隆及分析[A];第二屆全國種子科學(xué)與技術(shù)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2011年

9 張計育;莫正海;黃勝男;賈曉東;宣繼萍;郭忠仁;;薄殼山核桃MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子基因CiAG的克隆與功能分析[A];中國園藝學(xué)會2014年學(xué)術(shù)年會論文摘要集[C];2014年

10 王斌;張文根;山紅艷;孔宏智;;AP1和CAL類MADS-box基因調(diào)控區(qū)的功能分化研究[A];2011年全國系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)暨第十屆青年學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 羅義維;桑樹休眠相關(guān)MADS-box基因的功能研究[D];西南大學(xué);2018年

2 孫翠慧;MADS-box轉(zhuǎn)錄因子CmANR1調(diào)控菊花根系發(fā)育的機(jī)理研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

3 趙素珍;MADS-box基因在單子葉植物花發(fā)育中的功能研究[D];中國科學(xué)院研究生院（植物研究所）;2005年

4 郭濱;蝴蝶蘭花發(fā)育相關(guān)B類MADS-box基因的克隆與鑒定[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

5 程占超;毛竹MADS-box基因的鑒定及其在花器官發(fā)育中的功能[D];中國林業(yè)科學(xué)研究院;2016年

6 徐啟江;草原龍膽花器官M(fèi)ADS-box基因克隆與表達(dá)分析[D];東北林業(yè)大學(xué);2007年

7 殷文成;四個番茄MIKC~C型MADS-box基因的功能研究[D];重慶大學(xué);2017年

8 朱高浦;山茶花MADS-box家族B類基因克隆及在重瓣花形成中的作用[D];中國林業(yè)科學(xué)研究院;2011年

9 郭緒虎;兩個番茄MIKC~C型MADS-box基因的功能研究[D];重慶大學(xué);2017年

10 徐宗大;梅花花器官發(fā)育相關(guān)MADS-box基因的功能分析[D];北京林業(yè)大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 郭鵬;十字花科MADS-box基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2018年

2 譚文勃;草原龍膽C類MADS-box基因克隆與表達(dá)分析[D];東北林業(yè)大學(xué);2010年

3 林苗苗;甜櫻桃花發(fā)育相關(guān)MADS-box基因的克隆與分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

4 李天芳;施肥對白樺生長發(fā)育和幾個MADS-box基因表達(dá)的影響[D];東北林業(yè)大學(xué);2009年

5 劉雪瑩;胡蘿卜MADS-box基因克隆與表達(dá)分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

6 蔡曄;花生MADS-box基因保守序列的克隆與分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2009年

7 徐道蘭;問荊（Equisetum arvense）MADS-box基因的克隆與分析[D];上海師范大學(xué);2014年

8 黃赫;洋蔥A、B、C、E功能MADS-box基因的克隆與表達(dá)分析[D];東北林業(yè)大學(xué);2013年

9 張妙青;垂穗披堿草種子落粒性及其相關(guān)MADS-box基因研究[D];蘭州大學(xué);2011年

10 賴來;農(nóng)桿菌介導(dǎo)的MADS-box基因轉(zhuǎn)化黃瓜初步研究[D];上海交通大學(xué);2007年

本文編號：2654098