【摘要】：目的:觀察EPCR基因敲低的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)對(duì)博來(lái)霉素所致小鼠肺纖維化的治療作用,初步探索其可能的機(jī)制。方法:根據(jù)EPCR基因mRNA序列,合成3條小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)導(dǎo)入hUC-MSCs,通過檢測(cè)EPCR蛋白表達(dá),篩選干擾效果最佳si RNA。根據(jù)最佳siRNA序列構(gòu)建慢病毒載體,包裝重組慢病毒,感染h UC-MSCs,Real-time PCR和Western blot驗(yàn)證敲低效率。將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組(Ctrl)、模型對(duì)照組(B)、干細(xì)胞治療組(B+MSCs)、敲低組干細(xì)胞治療組(B+shRNA-EPCR-MSCs)、陰性對(duì)照組干細(xì)胞治療組(B+shRNA-NC-MSCs)。小鼠10%水合氯醛腹腔麻醉,無(wú)創(chuàng)氣管插管法分別給予空白對(duì)照組生理鹽水50μL,其余組給予同等體積博來(lái)霉素3mg/kg。建模后第7天,干細(xì)胞治療組、敲低組干細(xì)胞治療組、陰性對(duì)照組干細(xì)胞治療組經(jīng)氣管插管給予各自對(duì)應(yīng)細(xì)胞懸液5*10~5/50ul/只,空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等量無(wú)菌生理鹽水。造模后第21天處死小鼠并收集肺組織標(biāo)本,進(jìn)行HE和Masson染色,Ashcroft評(píng)分,Sircol法檢測(cè)肺內(nèi)可溶膠原量,以評(píng)定不同分組小鼠肺纖維化程度。最后體外構(gòu)建轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor beta1,TGF-β1)誘導(dǎo)干細(xì)胞向成纖維細(xì)胞分化模型,分別誘導(dǎo)敲低組和陰性對(duì)照組干細(xì)胞,Real-time PCR和Western blot檢測(cè)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和Ⅰ型膠原(type I collagen,ColⅠ)在誘導(dǎo)前后表達(dá)水平,以反映分化程度。結(jié)果:以EPCR最佳siRNA序列構(gòu)建EPCR基因RNAi慢病毒載體,成功減低hUC-MSCs內(nèi)EPCR的mRNA(P0.001)和蛋白(P0.001)表達(dá)。B+shRNA-EPCR-MSCs組小鼠較模型對(duì)照組中位生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P0.05),肺部病理改變較輕,Ashcroft評(píng)分較低(P0.05),肺內(nèi)膠原沉積較少(P0.05)。敲低組干細(xì)胞合成的ColⅠ在mRNA和蛋白水平(P0.05)均減少。體外TGF-β1誘導(dǎo)可增加hUC-MSCs內(nèi)α-SMA、ColⅠ的表達(dá)(mRNA水平,P0.05;蛋白水平,P0.05),促進(jìn)其向成纖維細(xì)胞分化。敲低EPCR可部分抑制TGF-β1所致α-SMA及ColⅠ表達(dá)增多(mRNA水平,P0.05;蛋白水平,P0.05)。結(jié)論:shRNA-EPCR-MSCs可以改善博來(lái)霉素所致小鼠肺纖維化,可能與敲低EPCR減少hUC-MSCs內(nèi)ColⅠ表達(dá),并減弱其向成纖維細(xì)胞分化有關(guān)。
【圖文】：

圖 1.1 siRNAs 轉(zhuǎn)入 hUC-MSCs 后 EPCR 蛋白表達(dá)的檢測(cè)1.1 Detection of the protein expression of EPCR after transfection of hUC-MSCs by siRNAs（注：A.EPCR 蛋白表達(dá)；B.EPCR 蛋白表達(dá)的量化分析a：與對(duì)照組比較，P＜0.001；b：與 siRNA-2 比較，，P＜0.001）

序列分析
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 梁艷;李濤;周克元;;慢病毒載體在RNA干擾中的應(yīng)用進(jìn)展[J];國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2010年11期

本文編號(hào)：2652888