【摘要】：轉(zhuǎn)AtNHX1-betA-TsVP基因棉花耐鹽性分析鹽漬化是全世界普遍存在土壤問題,很大程度上限制農(nóng)作物產(chǎn)量。大約全球6%土地受到鹽漬化影響并且有擴大的趨勢。棉花是全球最重要的自然纖維與主要產(chǎn)油作物來源。在中國目前棉產(chǎn)區(qū)主要向西北內(nèi)陸、瀕海鹽堿地聚集。提高棉花耐鹽性對于推廣其在鹽堿地中的大量種植及解決“糧棉蔬爭地”問題,有著重要的意義。甘氨酸甜菜堿(GB)作為一類的滲透保護(hù)物,可以有效地保護(hù)作物應(yīng)對多種非生物脅迫。來自大腸桿菌的betA基因編碼的膽堿脫氫酶能夠促進(jìn)膽堿合成GB。從鹽芥克隆得到的TsVP基因負(fù)責(zé)編碼H+-Ppase,其定位于植物液泡膜上,能為Na+在液泡中區(qū)隔化提供動力進(jìn)而維持離子平衡。植物液泡膜上存在負(fù)責(zé)將胞質(zhì)中Na+逆濃度梯度運輸?shù)揭号輧?nèi)的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白是由NHX1所編碼,過表達(dá)擬南芥中AtNHX1基因能顯著增強植物耐逆性。本實驗通過將三個負(fù)責(zé)兩種不同代謝途徑的基因共轉(zhuǎn)化到棉花中,以達(dá)到獲得耐鹽性顯著提高的棉花新種質(zhì)的目的。將AtNHX1-betA-TsVP基因利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入棉花中。選取大田鹽堿地中農(nóng)藝學(xué)性狀表現(xiàn)較佳的三個株系(ABT1、ABT2、ABT3)等T3代植株作為實驗材料,以轉(zhuǎn)TsVP基因的T83株系(T6代)、轉(zhuǎn)betA基因(T6代)的B29株系和魯棉研21號(WT)作為對照,從基因表達(dá)水平、鹽脅迫下的種子出苗、苗期與蕾期生理生化指標(biāo)測定、鹽堿地農(nóng)藝學(xué)性狀考察等諸多角度考察棉花的耐鹽性的差異。對轉(zhuǎn)AtNHX1-betA-TsVP基因植株的AtNHX1、betA TsVP基因進(jìn)行了 PCR檢測并利用q-PCR檢測了基因的表達(dá)水平,結(jié)果表明AtNHX1-betA-tSVP基因成功轉(zhuǎn)入棉花中并正常表達(dá)。沙培條件下各株系棉花在四葉期開始進(jìn)行鹽處理,分別取250 mM NaC1處理后第0、1、7、14、21天的植株材料測定各項生理狀況。研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫前各株系棉花在葉綠素含量、植株干重、相對水含量(RWC)、飽和滲透式、Na+、凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、FV/Fm、可溶性糖、離子滲漏、丙二醛含量(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)等指標(biāo)上無顯著差異。鹽脅迫處理后,相對于WT和轉(zhuǎn)betA、TsVP基因棉花,轉(zhuǎn)AtNHX1-betA-TsVP基因棉花ABT3具備顯著更高葉綠素含量、植株干重、RWC、Na+、Pn、Gs、Fv/Fm、可溶性糖、SOD酶活和顯著更低的飽和滲透式、離子滲漏、MDA。表明沙培條件下四葉期到蕾期轉(zhuǎn)AtNHX1-betA-TsVP棉花的耐鹽性最佳。水培條件下各株系棉花在四葉期開始進(jìn)行0 mM、150 mM、250 mM NaCl脅迫,分別取不同濃度NaCl處理后第0、18天的植株材料測定多項生理指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫處理前各棉花株系在RWC、飽和滲透式、干重、Pn、Fv/Fm等生理指標(biāo)上不存在顯著差異;鹽脅迫處理后,相比于WT和轉(zhuǎn)betA、TsVP基因棉花,轉(zhuǎn)AtNHX1-betA-TsVP基因棉花ABT3具有顯著更高的RWC、干重、Pn、Fv/Fm和顯著更低的飽和滲透式。表明水培條件下轉(zhuǎn)AtNHX1-betA-TsVP基因棉花的耐鹽能力最佳。鹽脅迫下種子出苗實驗測定了棉花的出苗率、植株株高和干重。結(jié)果表明,在0 mM NaCl處理下各株系棉花的出苗率和干重?zé)o顯著差異;在200 mM NaCl條件下轉(zhuǎn)基因棉花的出苗率、株高和干重顯著高于WT,轉(zhuǎn)AtNHX1-betA-TsVP棉花比轉(zhuǎn)betA/TsVP基因棉花具備更高出苗率和植株干重。因此,轉(zhuǎn)AtNHX1-betA-TsVP基因棉花在種子出苗期比轉(zhuǎn)TsVP/betA基因棉花和WT具有更強耐鹽能力。東營鹽堿地大田條件下,我們對不同棉花株系的大田籽棉產(chǎn)量等農(nóng)藝學(xué)性狀、Pn和Fv/Fm進(jìn)行了測量與分析。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明,轉(zhuǎn)AtNHX1-betA-TsVP基因棉花植株相比于其它株系棉花具有更高Pn、Fv/Fm、籽棉產(chǎn)量和更好的大田農(nóng)藝學(xué)表現(xiàn)。實驗結(jié)果說明將AtNHX1-betA-TsVP基因轉(zhuǎn)化到棉花中可以很大程度上增強棉花耐鹽能力。轉(zhuǎn)GhPEAMT-betA基因棉花植株的獲得GhPEAMT基因負(fù)責(zé)編碼磷酸乙醇胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶,能夠催化磷酸乙醇胺經(jīng)過三步甲基化生成磷酸膽堿,是膽堿生物合成關(guān)鍵酶。betA基因負(fù)責(zé)編碼膽堿脫氫酶能夠催化膽堿生成甜菜堿醛,其是甜菜堿合成關(guān)鍵酶。將GhPEAMT-betA轉(zhuǎn)化到棉花中有可能增強棉花細(xì)胞中甜菜堿的水平,有望增強棉花抗逆能力。本實驗將GhPEAMT、betA基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體上,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)化到棉花細(xì)胞中,通過草甘膦初步篩選、PCR鑒定,獲得轉(zhuǎn)GhPEAMT-betA基因棉花。
【圖文】：

逡逑圖１－１植物細(xì)胞中的離子平衡［４３］逡逑ＳＯＳ途徑對于植物中Ｎａ＋／Ｋ＋離子平衡的調(diào)節(jié)至關(guān)重要［４４］。ＳＣａＢＰ８通過直接逡逑同ＡＫＴ１邋Ｃ－末段相互作用抑制Ｋ＋離子通道ＡＫＴ１的活性。鹽脅迫下，Ｓ０Ｓ２通過逡逑磷酸化ＳＣａＢＰ８與質(zhì)膜的建立聯(lián)系［２８，邋４５］。ＳＯＳ２對ＳＣａＢＰ８的磷酸化作用是否能逡逑減少ＳＣａＢＰ８與ＡＫＴ１的相互作用進(jìn)而釋放ＡＫＴ１的活性增加Ｋ＋的吸收來應(yīng)對逡逑鹽脅迫尚不清楚。假設(shè)上述過程存在，ＳＯＳ２可通過對ＳＣａＢＰ８和ＳＯＳ１的磷酸逡逑化激活ＡＫＴ１和Ｓ０Ｓ１，從而維持細(xì)胞質(zhì)中Ｎａ＋／Ｋ＋離子平衡。逡逑液泡膜Ｎａ＋區(qū)隔化是植物在高鹽條件下減少胞質(zhì)內(nèi)有毒離子積累一種重要逡逑適應(yīng)機制。Ｓ０Ｓ２可正向調(diào)節(jié)液泡膜Ｈ＋－ＡＴＰａＳｅ與Ｎａ＋／Ｈ＋轉(zhuǎn)運蛋白活性以減少胞逡逑質(zhì)中Ｎａ＋毒害。ＳＣａＢＰ８／ＣＢＬ１０可以與液泡膜上的ＳＯＳ２相互作用［４６］，表明ＳＣａＢＰ８逡逑可能與液泡膜Ｎａ＋區(qū)隔化有關(guān)。然而，，關(guān)于液泡膜ＮＨＸ轉(zhuǎn)運體還存在爭議。早逡逑期的研究報告表明ＮＨＸ１與液泡膜Ｎａ＋區(qū)隔化和植物鹽分耐受性有關(guān)ｔ４＇近期有逡逑報告表明ＮＨＸ１和ＮＨＸ２介導(dǎo)Ｋ＋進(jìn)入液泡；擬南芥《知２雙突變體在鹽分逡逑敏感程度和Ｎａ＋在液泡中的富集上沒有改變［４８，邋４９１。ＮＨＸ１和ＮＨＸ２的Ｋ＋通道活逡逑性是否被胞質(zhì)中Ｎａ＋濃度變化調(diào)節(jié)；ＮＨＸ１和ＮＨＸ２是否主要介導(dǎo)Ｋ＋和Ｈ＋交換

３．１轉(zhuǎn)基因棉花的分子鑒定結(jié)果逡逑３．１．１仙ＶＨＺ７、６此４、尸基因的ＰＣＲ鑒定結(jié)果逡逑本實驗中基因ＰＣＲ擴增片段大小為１５６６邋ｂｐ；從圖３－１邋ａ可以看出逡逑ＷＴ和以水為模版的陰性對照中未檢測到基因存在，而轉(zhuǎn)逡逑基因棉花株系ＡＢＴ１、ＡＢＴ２、ＡＢＴ３中均檢測到Ａ７ＶＨＺ７基因逡逑的存在。基因ＰＣＲ擴增片段大小為９００邋ｂｐ；從圖３－１邋ｂ可以看出ＷＴ和以水逡逑為模版的陰性對照中未檢測到基因的存在，而轉(zhuǎn)基因棉花株系Ｂ２９和逡逑轉(zhuǎn)基因棉花株系ＡＢＴ１、ＡＢＴ２、ＡＢＴ３中均檢測到基因逡逑存在。Ｋ印基因ＰＣＲ擴增片段大小為６５４邋ｂｐ；從圖３－１邋ｃ可以看出ＷＴ未檢測逡逑到基因存在，而過表達(dá)ＫＦＰ基因棉花株系Ｔ８３和轉(zhuǎn)基逡逑因棉花株系ＡＢＴ１、ＡＢＴ２、ＡＢＴ３中均檢測到ＫｆＴ基因的存在。逡逑ａ邋Ｍ邋Ｐ邋ＣＫ邋Ｈ２0邋１邐２邐３邐４邐５邐６邐７邐８邋Ｐ邋Ｍ逡逑ｚＢｇｍｍｍｓ逡逑邐邐邐逡逑ｂ邋Ｍ邋Ｐ邋ＣＫ邋Ｈ２Ｑ邋１邋２邋３邋４邋５邋６邋７邋？邋Ｍ逡逑２０００ｂｐｍＭ｜逡逑３００ｂｐ［逡逑２５０ｂｐＰ邐ｈ邐－｜逡逑ｌＯＯｂｐＰ邐＇逡逑Ｃ邋Ｍ邋Ｐ邋ＣＫ邋１邋２邋３邋４邋３邋６邋７８逡逑２０００ｂｐＭ邋＂＾ＪＳｒ；邋｜＿一夂，逡逑ｌＯＯＯｂｐＢ邐：，．，‘？、一＿，－＇，、邐１逡逑７；0ｂｐＥＪ＇逡逑３０Ｃｌｂｐ■、一二】ｒ邐７、‘．：邋ｔ邋１邋丨丨逡逑２５０ｂｐＰ邐
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S562

【參考文獻(xiàn)】

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3 Jullyana Cristina Magalhaes Silva Moura;Cesar Augusto Valencise Bonine;Juliana de Oliveira Fernandes Viana;Marcelo Carnier Dornelas;Paulo Mazzafera;;Abiotic and Biotic Stresses and Changes in the Lignin Content and Composition in Plants[J];Journal of Integrative Plant Biology;2010年04期

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本文編號：2652266