【摘要】：葡萄(Vitis vinifrea L.)作為世界性水果代表之一,其栽培極易受到外界氣候和病蟲害危害,尤其是歐洲葡萄極易受到白粉病、灰霉病、霜霉病和黑痘病等的侵染,中國(guó)野生葡萄等對(duì)多種病原菌表現(xiàn)高度抗性或免疫。本文以課題組前期研究為基礎(chǔ),一方面開展毛葡萄(Vitis quinquangularis)‘商-24’轉(zhuǎn)錄因子VqJAZ4和VqJAZ9的抗病功能研究,分別利用VqJAZ4和VqJAZ9轉(zhuǎn)基因擬南芥株系研究2個(gè)基因?qū)Π追鄄『突颐共〉目共№憫?yīng),分析VqJAZ4的啟動(dòng)子序列,并利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與VqJAZ4互作基因。另一方面,對(duì)葡萄TLPs基因家族進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)和定位葡萄TLPs對(duì)不同病原菌的響應(yīng)。采用RT-PCR從‘商-24’克隆VqTLP15和VqTLP29,利用轉(zhuǎn)基因擬南芥株系對(duì)VqTLP15和VqTLP29進(jìn)行抗病功能研究。取得的主要結(jié)果如下:1、采用RT-PCR技術(shù)從抗病毛葡萄‘商-24’中克隆VqJAZ4 cDNA全長(zhǎng)序列,該基因開放閱讀框861 bp,編碼286個(gè)氨基酸。構(gòu)建VqJAZ4過量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥,轉(zhuǎn)基因株系提高了對(duì)白粉病的抗性,而對(duì)灰霉病的抗性降低。基因表達(dá)分析結(jié)果顯示,白粉病誘導(dǎo)后,VqJAZ4轉(zhuǎn)基因株系受SA與JA信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)參與對(duì)白粉病的抗性響應(yīng),而灰霉病接種處理后,VqJAZ4抑制JA信號(hào)通路中的MYC2-支徑,導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因株系降低了對(duì)灰霉病的抗性。VqJAZ4編碼區(qū)不具備自激活活性,通過酵母雙雜交文庫篩選,獲得互作GDSL脂肪酶基因。最終將VqJAZ4過量表達(dá)轉(zhuǎn)化感病的歐洲葡萄‘無核白’體細(xì)胞胚,獲得38個(gè)轉(zhuǎn)基因葡萄陽性株系。此外,從毛葡萄‘商-24’中同源克隆VqJAZ4上游1,465 bp啟動(dòng)子片段,該片段含有響應(yīng)于植物抗逆境脅迫、植物激素和防御反應(yīng)等多個(gè)順式作用元件,表明VqJAZ4啟動(dòng)子可能參與調(diào)控葡萄響應(yīng)生物與非生物的誘導(dǎo)反應(yīng)。2、從抗病毛葡萄‘商-24’中同源克隆開放閱讀框807 bp的VqJAZ9,該基因編碼268個(gè)氨基酸。構(gòu)建VqJAZ9過量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥,白粉病接種轉(zhuǎn)基因株系后,VqJAZ9通過參與調(diào)控SA與JA信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)提高了對(duì)白粉病的抗性,灰霉病接種處理后,轉(zhuǎn)基因株系中JA信號(hào)通路起到主導(dǎo)作用,VqJAZ9能參與抑制JA信號(hào)通路中的MYC2-支徑,導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因株系降低了對(duì)灰霉病的抗性,其功能與VqJAZ4相似。自激活試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VqJAZ9編碼區(qū)不具備自激活活性。3、利用葡萄基因組數(shù)據(jù)庫,鑒定獲得了葡萄TLPs基因家族33個(gè)成員,按照染色體的位置命名為VvTLP1-VvTLP33,其中29個(gè)基因包含完整的典型的thaumatin結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析的結(jié)果將葡萄VvTLP基因家族被分成4個(gè)亞家族:第I、II、III和IV亞家族,分別占據(jù)的比例為27.27%、54.55%、3.03%和15.15%�；蚪Y(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)分析表明了葡萄VvTLP進(jìn)化關(guān)系的多樣性。同線性分析發(fā)現(xiàn),葡萄18個(gè)基因(VvTLP1、VvTLP2、VvTLP3、VvTLP6、VvTLP7、VvTLP8、VvTLP9、VvTLP10、VvTLP11、VvTLP12、VvTLP13、VvTLP15、VvTLP16、VvTLP25、VvTLP26、VvTLP27、VvTLP31和VvTLP32)在葡萄第1、2、3、4、15和18號(hào)染色體上發(fā)生相互的串聯(lián)重復(fù),且葡萄12個(gè)VvTLP和擬南芥15個(gè)AtTLP之間發(fā)生20對(duì)串聯(lián)重復(fù)。利用PCR技術(shù)分析葡萄33個(gè)VvTLP不同的表達(dá)模式,分別使用黑痘病接種處理抗病葡萄‘商-24’和感病葡萄‘紅地球’,白粉病接種處理抗病葡萄‘商-24’和感病葡萄‘湖南-1’,灰霉病接種處理抗病葡萄‘雙優(yōu)’和感病葡萄‘紅地球’,結(jié)果表明,黑痘病接種后提高了23個(gè)基因的表達(dá)量;白粉病接種后提高了14個(gè)基因的表達(dá)量;灰霉病接種后提高了19個(gè)基因的表達(dá)量,其中6個(gè)基因(VvTLP3、VvTLP6、VvTLP7、VvTLP8、VvTLP12和VvTLP29)的表達(dá)水平同時(shí)表現(xiàn)出上升。4、采用RT-PCR技術(shù)從抗病毛葡萄‘商-24’克隆了VqTLP15和VqTLP29 cDNA全長(zhǎng)序列,分別具有891 bp和735 bp的開放閱讀框,編碼296個(gè)和244個(gè)氨基酸,而且與已知的黑比諾同源基因GSVIVT01018769001和GSVIVT01008423001的高度同源。VqTLP15和VqTLP29的蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)都存在信號(hào)肽裂解位點(diǎn)。利用葡萄原生質(zhì)體研究發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因均定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)。構(gòu)建過量表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥,VqTLP15轉(zhuǎn)基因株系提高了對(duì)白粉病和假單胞菌DC3000的抗性,降低了對(duì)灰霉病的抗性。相關(guān)基因的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)VqTLP15過量表達(dá)能影響SA和JA/Eth信號(hào)通路,改變擬南芥對(duì)白粉病、灰霉病和DC3000的免疫反應(yīng)。VqTLP29的抗病功能與VqTLP15相似,VqTLP29轉(zhuǎn)基因株系也提高了對(duì)白粉病和DC3000的抗性,降低了對(duì)灰霉病的抗性。相關(guān)基因的表達(dá)分析表明VqTLP29過量表達(dá)可以作為一種調(diào)節(jié)因子,通過影響SA或JA/Eth信號(hào)通路誘發(fā)擬南芥對(duì)白粉病、灰霉病和DC3000的多種免疫反應(yīng)。
【圖文】：

變體中 JA 含量的增加會(huì)加速蛋白降解過程。擬南芥 JAZ7 突變體7 受到抑制后，突變體增強(qiáng)了對(duì) JA 的敏感性，JAZ7 突變體中 JA 的表達(dá)水平上升，影響擬南芥植株的生長(zhǎng)發(fā)育，降低了對(duì)細(xì)菌病害AZ7 與轉(zhuǎn)錄因子 MYC3、MYC4 或阻遏物（JAM1）相互作用，，同與TPL結(jié)合介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制作用。擬南芥JAZ7突變體中失調(diào)的異源J成COI1-JAZ-TPL-TF的復(fù)合物，導(dǎo)致激活了JA信號(hào)通路（Louise e，JAZ 蛋白可以通過與 MYC2 轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，還能轉(zhuǎn)錄激的表達(dá)（Abe et al. 2003）。此外，水稻 OsJAZ9 轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)的耐受性，但 OsJAZ4 不受 JA 誘導(dǎo)表達(dá)（Ye et al. 2009）。擬南Z 都可以通過與 MYC 結(jié)合產(chǎn)生抗病功能。擬南芥 JAZ5 和 JAZ10 的轉(zhuǎn)錄重新編程，共同參與限制 COR 細(xì)胞毒性和病原菌的生長(zhǎng)MYC2 的調(diào)節(jié)，也不需要同源的 MYC3 和 MYC4。擬南芥 jaz5/jaz1雙突變體株系主要由 SA 信號(hào)途徑介導(dǎo)參與防御病原菌的入侵（

不同顏色分別標(biāo)記葡萄 1-19 號(hào)染色體，圓圈中的曲線圖表示 VVJAZ 序列之間的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域。Figure 2-2 Chromosome distribution and synteny analysis of grape VVJAZChromosomes 1-19 are shown in different colors in a circular diagram. The approximate distribution oeach VVJAZ is marked with a short red line on the circle. Colored curves denote the details of synteniregions between VVJAZ.
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S436.631

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2651464