【摘要】：三疣梭子蟹Portunus trituberculatus屬于甲殼綱Crustacea、十足目Decapoda、梭子蟹科Portunidae,是重要的海洋經(jīng)濟動物,在我國分布廣泛。三疣梭子蟹屬大型廣鹽性水生甲殼動物,可在鹽度為13.7-47.7的環(huán)境中生存,具有生殖洄游習性,其產(chǎn)卵地多位于港灣或河口低鹽區(qū),并在深海高鹽區(qū)越冬。鹽度成為影響三疣梭子蟹生長發(fā)育至關重要的環(huán)境因子之一,對其攝食、蛻皮、生長、代謝、免疫等具有重要作用。因此,進行鹽度適應機制研究對三疣梭子蟹耐鹽良種的培育具有重要意義。為解析三疣梭子蟹鹽度適應機制,本論文設計了以下研究內(nèi)容:首先,通過新一代測序技術對鹽度耐受性性狀差異三疣梭子蟹鰓組織進行高通量表達譜測序,通過比較轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)掘鹽度適應相關基因;其次,在比較轉(zhuǎn)錄組分析基礎上,我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肽家族基因在三疣梭子蟹鹽度耐受性性狀差異家系間以及鹽度脅迫后顯著差異表達,推測神經(jīng)肽可能在三疣梭子蟹鹽度適應中具重要作用。因此,挑選了蝗抗利尿肽、甲殼動物心激肽、甲殼動物高血糖素等基因,通RCAE、染色體步移等技術獲得c DNA或基因組全長序列,并進一步通過qPCR、RNAi及酶活測試等分子生物學技術解析其在低鹽適應中的分子機制,主要研究結果如下:1.低鹽脅迫下三疣梭子蟹鰓表達譜分析采用新一代測序技術對鹽度耐受性性狀差異三疣梭子蟹鰓組織進行高通量表達譜測序,測序10個樣本平均產(chǎn)生23,941,392條clean reads,與參考序列比對率為86.74%。利用比較轉(zhuǎn)錄組學方法發(fā)掘差異表達基因9,475條,涉及離子轉(zhuǎn)運蛋白基因、離子通道蛋白基因、神經(jīng)肽基因和氨基酸代謝相關基因等。比較低鹽耐受型家系和低鹽敏感型家系差異基因發(fā)現(xiàn),離子轉(zhuǎn)運基因顯著差異表達,包括Na~+/K~+-ATPase(上調(diào))、V-ATPase(上調(diào))、碳酸酐酶(上調(diào))、幾丁質(zhì)酶(下調(diào))和鈣網(wǎng)蛋白(下調(diào))等,此外熱休克蛋白、代謝相關的精氨酸激酶等均顯著上調(diào)。GO富集分析結果顯示,差異基因主要富集于生物調(diào)節(jié)、細胞過程、代謝過程、單有機體過程、細胞組分、細胞膜、細胞器、結合、催化活性、轉(zhuǎn)運活性等GO條目。KEGG信號通路富集結果顯示,差異基因主要富集于代謝通路,吞噬小體通路,癌通路和核糖體蛋白通路。此外我們從轉(zhuǎn)錄組中篩選到33個神經(jīng)肽基因及相關受體基因,從表達譜中篩選到三個鹽度相關的神經(jīng)肽基因(蝗抗利尿肽、甲殼動物心激肽、甲殼動物高血糖素),并且顯著差異表達,為我們后續(xù)研究提供了實驗基礎。2.低鹽脅迫下蝗抗利尿肽基因的表達分析采用RACE技術克隆了三疣梭子蟹蝗抗利尿肽基因(PtNP)。PtNP基因全長1920 bp,5’非編碼區(qū)237 bp,3’非編碼區(qū)1373 bp,開放閱讀框309 bp,編碼102個氨基酸,預測分子量10.8 kDa,理論等電點7.42。PtNP含有12個半胱氨酸殘基,具十足目動物蝗抗利尿肽典型的特征。同源性和系統(tǒng)進化分析表明,PtNP與擬穴青蟹NP4的同源性最高(89%),并且三疣梭子蟹與擬穴青蟹首先聚為一支。組織表達分析發(fā)現(xiàn),PtNP基因在腦組織中的相對表達量最高,其次是鰓和眼柄,在卵巢、肌肉、心臟和肝胰腺中表達量較低或不表達。分析PtNP基因在低鹽脅迫過程中的表達模式發(fā)現(xiàn),低鹽脅迫可顯著改變PtNP基因在腦、鰓和眼柄組織中的表達變化,整體呈上調(diào)表達趨勢,其中在腦、鰓和眼柄中表達量分別最高上調(diào)7.7倍、2.8倍和2.6倍(P0.05)。去除眼柄后,PtNP基因在鰓中的表達成上升趨勢,且去除雙側眼柄組的表達量顯著高于去除單側眼柄組(P0.05)。本研究結果表明PtNP基因在三疣梭子蟹鹽度適應中可能發(fā)揮一定作用且受神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控。3.甲殼動物心激肽基因克隆及在低鹽適應中的功能驗證采用RACE技術克隆獲得三疣梭子蟹甲殼動物心激肽(CCAP)基因。該基因全長606 bp,5’端非編碼區(qū)72 bp,3’端非編碼區(qū)108 bp,開放閱讀框426 bp,編碼141個氨基酸,預測分子量15.6 kDa,理論等電點9.55。同源性分析表明,三疣梭子蟹CCAP與擬穴青蟹、藍蟹的CCAP同源性較高,分別為85%和82%。系統(tǒng)進化分析顯示,三疣梭子蟹與藍蟹首先聚為一支,之后的聚類為擬穴青蟹。組織表達分析發(fā)現(xiàn),CCAP基因在胸神經(jīng)節(jié)中的相對表達量最高,其次是腦和眼柄組織。通過分析CCAP基因在低鹽脅迫過程中的表達規(guī)律發(fā)現(xiàn),低鹽可顯著改變CCAP在胸神經(jīng)節(jié)中的表達模式,在24、48和72h實驗組的表達量顯著高于對照組(P0.05)分別為對照組的1.73,2.16和2.19倍。體外注射CCAP多肽可降低三疣梭子蟹在低鹽條件下的死亡率,并誘發(fā)Na~+/K~+-ATPase和V-ATPase酶活力顯著提高。本實驗結果暗示CCAP可能通過調(diào)控三疣梭子蟹Na~+/K~+-ATPase和V-ATPase活力,從而發(fā)揮一定的鹽度適應功能。4.高血糖素DNA全長克隆及在低鹽適應中的機理研究利用PCR擴增和染色體步移技術獲得CHH基因組及其啟動子序列。三疣梭子蟹CHH基因組包含4個外顯子和3個內(nèi)含子,全長3849bp,通過可變剪接產(chǎn)生兩種轉(zhuǎn)錄本Pt-CHH1和Pt-CHH2。Pt-CHH1由外顯子1,2和4組成,Pt-CHH2由外顯子1,2,3和4組成。獲得的CHH基因啟動子序列長度約為3kb。運用生物信息學對CHH基因全長分析,結果顯示,轉(zhuǎn)錄起始位點(0bp)上游31 bp處存在TATA box,核心啟動子區(qū)位于-40~+9 bp,同時在啟動子上發(fā)現(xiàn)多個轉(zhuǎn)錄因子結合位點(Oct-1、NF-kappa B、GATA-1、TBP、AP-1等)。低鹽脅迫下,Pt-CHH2基因在鰓組織中的表達模式發(fā)生了顯著變化,整體呈上調(diào)表達趨勢;注射dsRNA后Pt-CHH2基因在鰓組織中的表達量顯著下降,并且使得Na~+/K~+-ATP和碳酸酐酶酶活力下降。研究結果表明,CHH基因在三疣梭子蟹滲透壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮了一定作用,可能通過調(diào)節(jié)Na~+/K~+-ATPase和碳酸酐酶酶活力對體內(nèi)滲透壓進行調(diào)節(jié)。
【圖文】：

調(diào)控作用要由甲殼動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（圖 1-1和激素的合成與釋放起著至關重要見表 1-1[24]，主要參與甲殼動物的生中。有證據(jù)顯示滲透壓調(diào)節(jié)受神經(jīng)內(nèi)了重要作用[25]。在低鹽條件下，切除血淋巴滲透壓降低，，而注射竇腺勻漿某種物質(zhì)使得體內(nèi)滲透壓升高[26]；殼動物體內(nèi)，結果顯示鰓絲表面 Na節(jié)鰓絲表面的水流速度，進而調(diào)節(jié)滲表明，當外界鹽度改變時，提前注射平衡；從中華絨鰲蟹 Eriocheir sine鰓組織 Na+的滲入的功能，對 Na+的氨基酸（FAA）的含量也起調(diào)節(jié)作用

91.2.3 生物信息學分析首先對測序所得的數(shù)據(jù) raw reads 進行質(zhì)控(QC)，以確定測序數(shù)據(jù)的有然后將得到的 clean reads 比對到參考序列，通過統(tǒng)計比對率、reads 在參考的分布情況等，判斷比對結果是否通過第二次質(zhì)控。若通過則進行基因定量基于基因表達水平的各項分析（主成分、差異基因篩選等等），并對篩選出間差異表達基因，進行 GO 功能顯著性富集分析、pathway 顯著性富集分析2-2）。
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：2650067