【摘要】：目的:采用RNAi干擾技術(shù)聯(lián)合楊梅素(Myricetin,Myric)下調(diào)脂肪特異性蛋白(fatspecific protein of 27 kD,Fsp27)的表達,觀察對3T3-L1細胞中脂代謝的影響,并對脂滴發(fā)生、發(fā)展變化的調(diào)控機制進行探究,為肥胖癥的防治提供新的理論基礎(chǔ)和藥物篩選靶點。方法:1.采用基因編輯技術(shù)克隆構(gòu)建針對Fsp27的3個sh-RNA陽性干擾載體和1個陰性對照載體,并通過DNA測序法對其進行鑒定。2.常規(guī)培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞,采用“雞尾酒法”,使其誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細胞。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細胞。實驗分為四組:對照組(control group)、轉(zhuǎn)染組(sh-RNA group)、楊梅素組(Myric group)和聯(lián)合干預(yù)組(Myric+sh-RNA group)。脂肪細胞轉(zhuǎn)染5 h后,楊梅素組和聯(lián)合干預(yù)組以濃度為100μmol/L的Myric干預(yù)72 h。3.轉(zhuǎn)染成功后,用油紅O對脂滴進行染色,觀察脂滴形態(tài)及大小的變化;用酶法測定細胞中甘油及甘油三酯(TG)的含量,觀察細胞脂代謝的變化。4.Western blot檢測Fsp27、HSL、ATGL、p38MAPK、p-p38MAPK和PPARγ的表達量。結(jié)果:1.誘導(dǎo)分化結(jié)束后,3T3-L1細胞形態(tài)由纖維樣變成圓形,并伴隨有細胞體積的增大。油紅O染色后,脂滴呈“戒環(huán)樣”分布于細胞核周圍。2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后,3個sh-RNA陽性干擾載體與陰性對照組相比,均能有效下調(diào)Fsp27的表達量,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.干預(yù)后,與對照組相比,楊梅素(Myric)組的細胞中甘油三酯(TG)含量下降,甘油含量升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),但sh-RNA轉(zhuǎn)染組和楊梅素(Myric)組二者之間沒有差異(P0.05)。與其他三組相比,Myric+sh-RNA組細胞中TG含量明顯減少,甘油含量顯著增加,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.干預(yù)后,與對照組相比,其余三組細胞內(nèi)Fsp27的表達量均顯著降低;ATGL和PPARγ的表達量升高(P0.05)。另外,Myric+sh-RNA組和Myric組細胞內(nèi)HSL的表達量和p-p38MAPK/p38MAPK的比值均大于sh-RNA組和對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論:1.3個sh-RNA陽性干擾載體構(gòu)建成功,并且可有效下調(diào)Fsp27蛋白的表達。2.Fsp27基因沉默與楊梅素聯(lián)合干預(yù)可以更大程度地促進脂肪分解代謝。3.楊梅素可通過激活MAPK信號通路,上調(diào)HSL和ATGL的蛋白表達來發(fā)揮其促脂解的作用;sh-Fsp27高效干擾載體只是通過調(diào)節(jié)PPARγ和Fsp27蛋白的表達,增加ATGL含量來加速脂肪分解,可能對MAPK信號通路并不產(chǎn)生作用。
【圖文】：

圖 1-1 GV104 真核表達載體表 1-1 小鼠 sh-Fsp27 重組載體靶點 干擾靶點序列 起始位置 GC 含量1 ACCCTCTATGACACATACT 549 422 GGACATCTTGAAACTTAAA 269 313 CTCCTGTAAGTAACCTAAA 1507 360 TTCTCCGAACGTGTCACGT 222 52的轉(zhuǎn)化μL 質(zhì)粒加入 100μLDH5α 大腸桿菌感受態(tài)細胞中，，輕彈管壁數(shù)下混30 min。42 ℃熱激 90 s，冰水浴孵育 2 min。加入 500 μL LB 液體培搖床搖菌 1 h。

圖 1-2 sh-Fsp27 質(zhì)粒電泳鑒定注 1：sh-Fsp27-0；2：sh-Fsp27-1；3：sh-Fsp27-2；4：sh-Fsp27-3Fsp27 重組干擾載體的測序鑒定 DNA 測序結(jié)果證實，3 個 sh-Fsp27 陽性干擾載體中的插入的 sh，與預(yù)期設(shè)計合成的序列相符合。見圖 1-3。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R589.2

【參考文獻】

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本文編號：2646533