【摘要】：透明帶(zona pellucida,ZP)蛋白是由ZP基因家族編碼的構(gòu)成動(dòng)物卵子和早期胚胎外膜的一類糖蛋白。這種細(xì)胞外膜在生物體內(nèi)起著非常重要的構(gòu)造功能,并且在卵子的形成、卵細(xì)胞的受精和胚胎的發(fā)育過程中起著非常重要的生理生化作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)方法的快速發(fā)展,ZP蛋白的組成、形成過程和生理功能都得到了較深入的研究。然而,隨著越來越多的ZP蛋白從不同物種中克隆分離出來,到目前為止尚缺乏一個(gè)統(tǒng)一的ZP基因命名體系,且關(guān)于脊椎動(dòng)物全基因組尺度ZP基因的鑒定也有待開展。此外,ZP蛋白的表達(dá)在四足類已比較清晰,在不同類群中得到了較一致的研究結(jié)果。然而,ZP蛋白在魚類中數(shù)量繁多,表達(dá)情況比較復(fù)雜,不同物種ZP蛋白的組織表達(dá)差異較大,迄今尚未得到明晰而一致的結(jié)果。本研究對(duì)脊椎動(dòng)物的ZP基因開展了全基因組范圍的鑒定,并試圖為脊椎動(dòng)物的ZP基因建立一個(gè)具有較好流行性、通用性和簡(jiǎn)約性的命名體系。同時(shí),對(duì)尼羅羅非魚的7個(gè)不同組織,以及4個(gè)不同發(fā)育階段性腺的ZP基因表達(dá)模式作了轉(zhuǎn)錄組水平上的分析。通過RT-PCR和原位雜交驗(yàn)證尼羅羅非魚ZP基因的組織分布及其在不同組織中的細(xì)胞定位;分析了dax1和42Sp50純合突變尼羅羅非魚卵巢的ZP基因表達(dá)。此外,研究了雌二醇和芳香化酶抑制劑分別誘導(dǎo)的XY和XX性逆轉(zhuǎn)尼羅羅非魚ZP基因的表達(dá),以及雌二醇、甲基睪酮和芳香化酶抑制劑letrozole對(duì)離體孵育肝臟和性腺ZP基因表達(dá)的影響,為進(jìn)一步研究ZP基因的功能奠定基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:1脊椎動(dòng)物ZP基因的分離鑒定在七鰓鰻、象鯊、腔棘魚、斑點(diǎn)雀鱔、斑馬魚、尼羅羅非魚、青淏、三棘刺魚、花溕、劍尾魚、海馬、烏鱧、墨西哥脂鯉、黑青斑河豚、爪蟾、中華鱉、雞、鴨嘴獸、袋鼠和人的基因組中發(fā)現(xiàn)了16,9,17,27,21,19,20,26,14,11,24,17,9,18,8,11,9,8,5和4個(gè)ZP基因。脊椎動(dòng)物ZP基因的數(shù)量從低等到高等,從水生到陸生,從卵生到胎生的進(jìn)化過程中,總的趨勢(shì)是逐漸減少,且與卵子受精和胚胎發(fā)育的環(huán)境有關(guān)。2 ZP基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析用氨基酸序列構(gòu)建脊椎動(dòng)物ZP基因系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,脊椎動(dòng)物ZP基因可以分為5個(gè)亞家族:ZPA、ZPB、ZPC、ZPD和ZPAX。ZPA存在于除軟骨魚類和真骨魚類之外的脊椎動(dòng)物。ZPB和ZPC亞家族存在于所有脊椎動(dòng)物類群中。ZPD存在于除圓口類、墨西哥脂鯉、后獸類和真獸類外的脊椎動(dòng)物。ZPAX基因存在于真獸類之外所有脊椎動(dòng)物。ZP基因的命名遵照系統(tǒng)發(fā)生的層級(jí)制度:首先,亞家族(大寫字母);然后,一級(jí)旁系標(biāo)簽(阿拉伯?dāng)?shù)字);再后,二級(jí)旁系標(biāo)簽(小寫字母,如必要);最后,串接標(biāo)簽(短線-阿拉伯?dāng)?shù)字)。3 ZP基因在尼羅羅非魚7個(gè)組織中的表達(dá)模式分析通過對(duì)性成熟尼羅羅非魚7個(gè)組織(腦、心臟、肝臟、精巢、腎臟、頭腎和卵巢)的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),19個(gè)ZP基因中有2個(gè)(ZPB1a和ZPB2c)在7個(gè)組織中均處于本底表達(dá),有2個(gè)(ZPB2b和ZPC2)僅高表達(dá)于肝臟中,剩余的15個(gè)都高表達(dá)于卵巢中,在其他組織中基本處于本底表達(dá)狀態(tài)。4 ZP基因在尼羅羅非魚組織分布的RT-PCR驗(yàn)證RT-PCR驗(yàn)證分析表明,ZPB2b和ZPC2在XX成魚的肝臟高表達(dá),而ZPAX1、ZPAX4、ZPC5-1和ZPC5-2則在卵巢高表達(dá),該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。5 ZP基因在尼羅羅非魚不同發(fā)育時(shí)期性腺轉(zhuǎn)錄組中的表達(dá)模式分析在尼羅羅非魚的19個(gè)ZP基因中,ZPB1a、ZPB2b、ZPB2c、ZPC2和ZPAX2在性腺發(fā)育的所有階段中均不表達(dá)。剩余的14個(gè)ZP基因在孵化后5天(days after hatching,dah)的性腺中表達(dá)量低,在30 dah開始在卵巢中表達(dá),在90和180 dah時(shí)卵巢中高表達(dá),且表達(dá)量(RPKM值)均高于100。6 ZP基因表達(dá)的原位雜交驗(yàn)證通過原位雜交(In situ hybridization,ISH)對(duì)尼羅羅非魚ZPC2在肝臟、ZPC5-2、ZPAX1在卵巢的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證,同時(shí)也可對(duì)表達(dá)的細(xì)胞類型進(jìn)行定位。ISH結(jié)果顯示:ZPC2在肝臟的肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá),但在卵巢中不表達(dá);ZPC5-2在卵巢的I和II時(shí)相卵母細(xì)胞中表達(dá),而ZPAX1在卵巢I、II和III時(shí)相的卵母細(xì)胞中均有表達(dá),但二者在肝臟中均未見表達(dá)。7 ZP基因在dax1和42Sp50純合突變魚卵巢中的表達(dá)利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的dax1和42Sp50純合突變魚性腺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,分析了缺失Dax1和42Sp50對(duì)ZP基因表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)在30 dah時(shí),由于性腺中僅見卵原細(xì)胞,而對(duì)照組卻擁有卵原細(xì)胞和大量I時(shí)相卵母細(xì)胞,dax1~(-/-)卵巢中所有ZP基因的表達(dá)均低于對(duì)照卵巢。相反,在180 dah時(shí),42Sp50~(-/-)卵巢僅有I和II時(shí)相卵母細(xì)胞,而對(duì)照卵巢中大量II時(shí)相卵母細(xì)胞已發(fā)育至III、IV時(shí)相,因此,所有ZP基因在42Sp50~(-/-)卵巢中的表達(dá)均高于對(duì)照卵巢。可見,ZP基因的表達(dá)水平與卵巢中I、II時(shí)相卵母細(xì)胞數(shù)目明顯相關(guān)。8雌激素對(duì)尼羅羅非魚ZP基因表達(dá)的影響利用實(shí)驗(yàn)室前期完成的雌二醇(E_2)處理誘導(dǎo)的XY雌魚、芳香化酶抑制劑fadrozole處理誘導(dǎo)的XX雄魚的性腺轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,分析300 dah性腺中ZP基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)E_2誘導(dǎo)的XY雌魚ZP基因的表達(dá)均高于XY對(duì)照組,而fadrozole誘導(dǎo)的XX雄魚ZP基因的表達(dá)均低于XX對(duì)照組。同樣,用E_2處理離體培養(yǎng)的XY雄魚肝臟和精巢,能顯著上調(diào)ZP基因的表達(dá),而用甲基睪酮(MT)和芳香化酶抑制劑letrozole分別處理離體培養(yǎng)的XX雌魚肝臟和卵巢,均能顯著下調(diào)ZP基因的表達(dá)。這些結(jié)果表明,在尼羅羅非魚,ZP基因的表達(dá)受到雌激素水平的影響。綜上所述,本研究采用了適合所有脊椎動(dòng)物ZP基因的命名體系。脊椎動(dòng)物ZP基因可以分為5個(gè)亞家族,分別為ZPA、ZPB、ZPC、ZPD和ZPAX。脊椎動(dòng)物從低等到高等,從水生到陸生,從卵生到胎生的進(jìn)化過程中,ZP基因的數(shù)量總的趨勢(shì)是逐漸減少。尼羅羅非魚共有19個(gè)ZP基因。其中,ZPB1a和ZPB2c在不同組織和不同發(fā)育階段的性腺均未見表達(dá),ZPB2b和ZPC2在肝臟特異性高表達(dá),其余均在卵巢中表達(dá),且主要表達(dá)于I、II時(shí)相的卵母細(xì)胞。無論是肝臟還是性腺表達(dá)的ZP基因均受到雌激素的影響。總之,本文全面鑒定了脊椎動(dòng)物的ZP基因,研究了該家族成員的表達(dá)模式,為開展該基因在脊椎動(dòng)物進(jìn)化中的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1 卵的基本結(jié)構(gòu)。(引自 Claw & Swanson, 2012)igure 1 Basic structure of the egg (Cited from Claw & Swanson, 20帶的組成及 ZP 蛋白的結(jié)構(gòu)特征帶的成分除水之外，主要是一些糖蛋白，一般稱為透明帶蛋白（protein，ZPG），這些蛋白由 ZP 基因編碼。ZP 蛋白的共同分子的信號(hào)序列（signal sequence, SS），1 個(gè)大約 260AA 的 ZP 結(jié)，1 個(gè)共識(shí)弗林蛋白酶切割位點(diǎn)（consensus furin cleavage site，膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain，TMD），在某些情況下也idermal growth factor）結(jié)構(gòu)域（Goudet et al., 2008）或一個(gè)三葉 結(jié)構(gòu)域/P 結(jié)構(gòu)域）（Wassarman, 2008）。三葉草結(jié)構(gòu)域/P 結(jié)構(gòu)氨基酸殘基構(gòu)成的，富集半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域，可以作為 ZP點(diǎn)是出現(xiàn)連續(xù) 6 個(gè)半胱氨酸殘基，其 1 5、2 4、3 6 半胱氨酸相連。通常這樣的序列會(huì)出現(xiàn) 6 個(gè)拷貝。個(gè) ZP 結(jié)構(gòu)域坐落于多肽鏈靠近 C 端的位置，并且包含 8 個(gè)（

西南大學(xué)博士學(xué)位論文構(gòu)域（小鼠 ZP1 是個(gè)例外，不具有 P 結(jié)構(gòu)域（Monné & Jovine, 2011; Gupta et al2012），而 ZPD/ZPX2 卻具有一個(gè) EGF 結(jié)構(gòu)域（Goudet et al., 2008））；ZP1 和ZP4 在 N 端僅具有 1 個(gè)分離的 ZP-N 亞結(jié)構(gòu)域，ZP2/ZPA 和 ZPAX/ZPX1 有幾個(gè)而 ZP3/ZPC 和 ZPD 均沒有（圖 2）（Goudet et al., 2008）。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S917.4

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