【摘要】：透明帶(zona pellucida,ZP)蛋白是由ZP基因家族編碼的構(gòu)成動物卵子和早期胚胎外膜的一類糖蛋白。這種細胞外膜在生物體內(nèi)起著非常重要的構(gòu)造功能,并且在卵子的形成、卵細胞的受精和胚胎的發(fā)育過程中起著非常重要的生理生化作用。隨著分子生物學技術(shù)方法的快速發(fā)展,ZP蛋白的組成、形成過程和生理功能都得到了較深入的研究。然而,隨著越來越多的ZP蛋白從不同物種中克隆分離出來,到目前為止尚缺乏一個統(tǒng)一的ZP基因命名體系,且關(guān)于脊椎動物全基因組尺度ZP基因的鑒定也有待開展。此外,ZP蛋白的表達在四足類已比較清晰,在不同類群中得到了較一致的研究結(jié)果。然而,ZP蛋白在魚類中數(shù)量繁多,表達情況比較復雜,不同物種ZP蛋白的組織表達差異較大,迄今尚未得到明晰而一致的結(jié)果。本研究對脊椎動物的ZP基因開展了全基因組范圍的鑒定,并試圖為脊椎動物的ZP基因建立一個具有較好流行性、通用性和簡約性的命名體系。同時,對尼羅羅非魚的7個不同組織,以及4個不同發(fā)育階段性腺的ZP基因表達模式作了轉(zhuǎn)錄組水平上的分析。通過RT-PCR和原位雜交驗證尼羅羅非魚ZP基因的組織分布及其在不同組織中的細胞定位;分析了dax1和42Sp50純合突變尼羅羅非魚卵巢的ZP基因表達。此外,研究了雌二醇和芳香化酶抑制劑分別誘導的XY和XX性逆轉(zhuǎn)尼羅羅非魚ZP基因的表達,以及雌二醇、甲基睪酮和芳香化酶抑制劑letrozole對離體孵育肝臟和性腺ZP基因表達的影響,為進一步研究ZP基因的功能奠定基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:1脊椎動物ZP基因的分離鑒定在七鰓鰻、象鯊、腔棘魚、斑點雀鱔、斑馬魚、尼羅羅非魚、青淏、三棘刺魚、花溕、劍尾魚、海馬、烏鱧、墨西哥脂鯉、黑青斑河豚、爪蟾、中華鱉、雞、鴨嘴獸、袋鼠和人的基因組中發(fā)現(xiàn)了16,9,17,27,21,19,20,26,14,11,24,17,9,18,8,11,9,8,5和4個ZP基因。脊椎動物ZP基因的數(shù)量從低等到高等,從水生到陸生,從卵生到胎生的進化過程中,總的趨勢是逐漸減少,且與卵子受精和胚胎發(fā)育的環(huán)境有關(guān)。2 ZP基因家族的系統(tǒng)進化分析用氨基酸序列構(gòu)建脊椎動物ZP基因系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,脊椎動物ZP基因可以分為5個亞家族:ZPA、ZPB、ZPC、ZPD和ZPAX。ZPA存在于除軟骨魚類和真骨魚類之外的脊椎動物。ZPB和ZPC亞家族存在于所有脊椎動物類群中。ZPD存在于除圓口類、墨西哥脂鯉、后獸類和真獸類外的脊椎動物。ZPAX基因存在于真獸類之外所有脊椎動物。ZP基因的命名遵照系統(tǒng)發(fā)生的層級制度:首先,亞家族(大寫字母);然后,一級旁系標簽(阿拉伯數(shù)字);再后,二級旁系標簽(小寫字母,如必要);最后,串接標簽(短線-阿拉伯數(shù)字)。3 ZP基因在尼羅羅非魚7個組織中的表達模式分析通過對性成熟尼羅羅非魚7個組織(腦、心臟、肝臟、精巢、腎臟、頭腎和卵巢)的轉(zhuǎn)錄組表達譜分析發(fā)現(xiàn),19個ZP基因中有2個(ZPB1a和ZPB2c)在7個組織中均處于本底表達,有2個(ZPB2b和ZPC2)僅高表達于肝臟中,剩余的15個都高表達于卵巢中,在其他組織中基本處于本底表達狀態(tài)。4 ZP基因在尼羅羅非魚組織分布的RT-PCR驗證RT-PCR驗證分析表明,ZPB2b和ZPC2在XX成魚的肝臟高表達,而ZPAX1、ZPAX4、ZPC5-1和ZPC5-2則在卵巢高表達,該結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。5 ZP基因在尼羅羅非魚不同發(fā)育時期性腺轉(zhuǎn)錄組中的表達模式分析在尼羅羅非魚的19個ZP基因中,ZPB1a、ZPB2b、ZPB2c、ZPC2和ZPAX2在性腺發(fā)育的所有階段中均不表達。剩余的14個ZP基因在孵化后5天(days after hatching,dah)的性腺中表達量低,在30 dah開始在卵巢中表達,在90和180 dah時卵巢中高表達,且表達量(RPKM值)均高于100。6 ZP基因表達的原位雜交驗證通過原位雜交(In situ hybridization,ISH)對尼羅羅非魚ZPC2在肝臟、ZPC5-2、ZPAX1在卵巢的表達進行驗證,同時也可對表達的細胞類型進行定位。ISH結(jié)果顯示:ZPC2在肝臟的肝血竇內(nèi)皮細胞中表達,但在卵巢中不表達;ZPC5-2在卵巢的I和II時相卵母細胞中表達,而ZPAX1在卵巢I、II和III時相的卵母細胞中均有表達,但二者在肝臟中均未見表達。7 ZP基因在dax1和42Sp50純合突變魚卵巢中的表達利用實驗室構(gòu)建的dax1和42Sp50純合突變魚性腺轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,分析了缺失Dax1和42Sp50對ZP基因表達的影響。發(fā)現(xiàn)在30 dah時,由于性腺中僅見卵原細胞,而對照組卻擁有卵原細胞和大量I時相卵母細胞,dax1~(-/-)卵巢中所有ZP基因的表達均低于對照卵巢。相反,在180 dah時,42Sp50~(-/-)卵巢僅有I和II時相卵母細胞,而對照卵巢中大量II時相卵母細胞已發(fā)育至III、IV時相,因此,所有ZP基因在42Sp50~(-/-)卵巢中的表達均高于對照卵巢。可見,ZP基因的表達水平與卵巢中I、II時相卵母細胞數(shù)目明顯相關(guān)。8雌激素對尼羅羅非魚ZP基因表達的影響利用實驗室前期完成的雌二醇(E_2)處理誘導的XY雌魚、芳香化酶抑制劑fadrozole處理誘導的XX雄魚的性腺轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,分析300 dah性腺中ZP基因的表達,發(fā)現(xiàn)E_2誘導的XY雌魚ZP基因的表達均高于XY對照組,而fadrozole誘導的XX雄魚ZP基因的表達均低于XX對照組。同樣,用E_2處理離體培養(yǎng)的XY雄魚肝臟和精巢,能顯著上調(diào)ZP基因的表達,而用甲基睪酮(MT)和芳香化酶抑制劑letrozole分別處理離體培養(yǎng)的XX雌魚肝臟和卵巢,均能顯著下調(diào)ZP基因的表達。這些結(jié)果表明,在尼羅羅非魚,ZP基因的表達受到雌激素水平的影響。綜上所述,本研究采用了適合所有脊椎動物ZP基因的命名體系。脊椎動物ZP基因可以分為5個亞家族,分別為ZPA、ZPB、ZPC、ZPD和ZPAX。脊椎動物從低等到高等,從水生到陸生,從卵生到胎生的進化過程中,ZP基因的數(shù)量總的趨勢是逐漸減少。尼羅羅非魚共有19個ZP基因。其中,ZPB1a和ZPB2c在不同組織和不同發(fā)育階段的性腺均未見表達,ZPB2b和ZPC2在肝臟特異性高表達,其余均在卵巢中表達,且主要表達于I、II時相的卵母細胞。無論是肝臟還是性腺表達的ZP基因均受到雌激素的影響�？傊�,本文全面鑒定了脊椎動物的ZP基因,研究了該家族成員的表達模式,為開展該基因在脊椎動物進化中的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖 1 卵的基本結(jié)構(gòu)。(引自 Claw & Swanson, 2012)igure 1 Basic structure of the egg (Cited from Claw & Swanson, 20帶的組成及 ZP 蛋白的結(jié)構(gòu)特征帶的成分除水之外，主要是一些糖蛋白，一般稱為透明帶蛋白（protein，ZPG），這些蛋白由 ZP 基因編碼。ZP 蛋白的共同分子的信號序列（signal sequence, SS），1 個大約 260AA 的 ZP 結(jié)，1 個共識弗林蛋白酶切割位點（consensus furin cleavage site，膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain，TMD），在某些情況下也idermal growth factor）結(jié)構(gòu)域（Goudet et al., 2008）或一個三葉 結(jié)構(gòu)域/P 結(jié)構(gòu)域）（Wassarman, 2008）。三葉草結(jié)構(gòu)域/P 結(jié)構(gòu)氨基酸殘基構(gòu)成的，富集半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域，可以作為 ZP點是出現(xiàn)連續(xù) 6 個半胱氨酸殘基，其 1 5、2 4、3 6 半胱氨酸相連。通常這樣的序列會出現(xiàn) 6 個拷貝。個 ZP 結(jié)構(gòu)域坐落于多肽鏈靠近 C 端的位置，并且包含 8 個（

西南大學博士學位論文構(gòu)域（小鼠 ZP1 是個例外，不具有 P 結(jié)構(gòu)域（Monné & Jovine, 2011; Gupta et al2012），而 ZPD/ZPX2 卻具有一個 EGF 結(jié)構(gòu)域（Goudet et al., 2008））；ZP1 和ZP4 在 N 端僅具有 1 個分離的 ZP-N 亞結(jié)構(gòu)域，ZP2/ZPA 和 ZPAX/ZPX1 有幾個而 ZP3/ZPC 和 ZPD 均沒有（圖 2）（Goudet et al., 2008）。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

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本文編號：2643491