【摘要】：融合基因(fusion gene)是指兩個基因的一部分或者全部序列互相融合形成的一個新的基因,它們共用同一套調(diào)控序列(即啟動子、增強(qiáng)子、終止子等)。形成融合基因最常見的機(jī)制是染色體重排,其中包括染色體易位(translocation)、中間缺失(deletion)、反式剪切(trans-splicing)和倒位(inversion)等。融合蛋白是融合基因的表達(dá)產(chǎn)物。腫瘤轉(zhuǎn)移(cancer metastasis)是指原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞通過淋巴管、血管或通過其他途徑被帶到其他部位繼續(xù)生長,形成與原發(fā)部位相同類型的腫瘤的過程。一般腫瘤轉(zhuǎn)移多在病期的后期發(fā)生,但對于肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌及前列腺癌等早期就可以發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移�，F(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)某些特異性融合基因產(chǎn)生的融合蛋白對腫瘤的發(fā)生和細(xì)胞的增殖起到促進(jìn)作用。對于GOLT1A-Kiss1融合基因而言,是否它們的融合會對腫瘤的發(fā)生有著某種作用或怎樣作用的,我們?nèi)允遣磺宄�。目�?系統(tǒng)性的研究人涎腺腺樣囊性癌轉(zhuǎn)移過程中出現(xiàn)的特異性的基因融合事件并對其參與腫瘤轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制進(jìn)行解釋,并以此開發(fā)可用于臨床早期診斷腫瘤轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記和提供今后可用于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物靶點。方法:利用RNA-Seq高通量測序技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)進(jìn)行分析,確定與轉(zhuǎn)移相關(guān)的融合基因,利用PCR和Sanger測序等技術(shù)對轉(zhuǎn)移相關(guān)的融合基因進(jìn)行融合基因的表達(dá)模式分析,并證實其特異性存在于高轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞中;然后通過RACE等技術(shù)對融合基因的全長cDNA序列進(jìn)行克隆,并用序列分析軟件對其進(jìn)行分析,后再用分子克隆技術(shù)構(gòu)建GOLT1A-Kiss1融合基因以及Kiss1融合基因的相關(guān)表達(dá)載體;最后將構(gòu)建好的載體利用瞬轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入細(xì)胞中,并用Western blotting技術(shù)檢測KISS1蛋白的表達(dá)情況,用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測融合基因上游uAUGs對蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:通過PCR技術(shù)和Sanger測序確定GOLT1A-Kiss1基因融合事件的發(fā)生,并證實其特異性存在于SACC高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)CC-M的腫瘤細(xì)胞中;通過RACE等技術(shù)將融合基因的全長c DNA序列克隆出來后發(fā)現(xiàn)了融合基因的三種融合方式;用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建了pGL3-Fusion1-KISS1-GFP、p GL3-Fusion2-KISS1-GFP、pGL3-Fusion3-KISS1-GFP、pGL3-KISS1-GFP和Fusion1-Luc、Fusion2-Luc、Fusion3-Luc、KISS1-Luc以及其融合基因uAUGs全部突變后的載體;用PCR技術(shù)和Western blotting檢測Kiss1基因的mRNA水平及內(nèi)源性蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),其在高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系A(chǔ)CC-M中高mRNA水平低蛋白表達(dá)水平;雙熒光素酶實驗結(jié)果說明當(dāng)把融合基因的uAUGs全部突變后熒光素酶活性上升。結(jié)論:GOLT1A-Kiss1的鑒定提供了一種新的基因融合的作用機(jī)制:即通過基因融合改變基因的5’UTR并抑制抑癌基因Kiss1的表達(dá),從而激活癌癥發(fā)生或推動腫瘤轉(zhuǎn)移。同時,在包括涎腺腺樣囊性癌、非小細(xì)胞性肺癌、乳腺癌和肝癌的多種腫瘤模型中,GOLT1A-Kiss1的表達(dá)和腫瘤的轉(zhuǎn)移高度相關(guān),其有希望作為多種腫瘤臨床早期診斷及藥物開發(fā)的新的靶點。
【圖文】：

圖 2.1 pMD18-T 載體圖譜Figure 2.1 pMD18-T vector map是目的片段插入位置，序列如下所示：TGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCACTGCAGGTCGACGAT （ 目 的 片 段TAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGATTAATGAA按表 2.7 所示，，16℃連接 6h表 2.7 目的片段與 T 載體連接體系Table2.7 Fragment-T vector ligation system

照第二章中 2.2.2.3 中的 PCR 產(chǎn)物純化方法進(jìn)行便可。2.4.2 T 載體連接將純化后的幾種融合基因的全長 cDNA 按照表 2.7 的連接體系進(jìn)行 T 載體，并按照 2.2.2.3 的方法進(jìn)行鑒定和測序。其中鑒定時引物序列分別為 PGTGACCATGTACCAGCTGC ； P2 ： CTTTGGAACACTCCTGTAC ； P3TTATCGTGCTCCTACGC；P4: CTTGGTGAGAAGAGGCAGG，P1、P2 和 P游引物，P4 為下游引物，并以 ACC-M 的 cDNA 為模板。.3 實驗結(jié)果與討論.3.1 融合基因的鑒定及測序模 板 提 取 好 后 ， 利 用 我 們 事 先 設(shè) 計 的 引 物 GOLT1A-KISS1F1OLT1A-KISS1R1 來進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增驗證融合基因的存在。擴(kuò)增結(jié)果如圖 2.1 所
【學(xué)位授予單位】：湖北工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R730

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2643084