【摘要】：融合基因(fusion gene)是指兩個基因的一部分或者全部序列互相融合形成的一個新的基因,它們共用同一套調控序列(即啟動子、增強子、終止子等)。形成融合基因最常見的機制是染色體重排,其中包括染色體易位(translocation)、中間缺失(deletion)、反式剪切(trans-splicing)和倒位(inversion)等。融合蛋白是融合基因的表達產物。腫瘤轉移(cancer metastasis)是指原發(fā)灶的腫瘤細胞通過淋巴管、血管或通過其他途徑被帶到其他部位繼續(xù)生長,形成與原發(fā)部位相同類型的腫瘤的過程。一般腫瘤轉移多在病期的后期發(fā)生,但對于肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌及前列腺癌等早期就可以發(fā)生腫瘤轉移。現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)某些特異性融合基因產生的融合蛋白對腫瘤的發(fā)生和細胞的增殖起到促進作用。對于GOLT1A-Kiss1融合基因而言,是否它們的融合會對腫瘤的發(fā)生有著某種作用或怎樣作用的,我們仍是不清楚的。目的:系統(tǒng)性的研究人涎腺腺樣囊性癌轉移過程中出現(xiàn)的特異性的基因融合事件并對其參與腫瘤轉移的具體機制進行解釋,并以此開發(fā)可用于臨床早期診斷腫瘤轉移的分子標記和提供今后可用于抑制腫瘤轉移的藥物靶點。方法:利用RNA-Seq高通量測序技術并結合生物信息學進行分析,確定與轉移相關的融合基因,利用PCR和Sanger測序等技術對轉移相關的融合基因進行融合基因的表達模式分析,并證實其特異性存在于高轉移腫瘤細胞中;然后通過RACE等技術對融合基因的全長cDNA序列進行克隆,并用序列分析軟件對其進行分析,后再用分子克隆技術構建GOLT1A-Kiss1融合基因以及Kiss1融合基因的相關表達載體;最后將構建好的載體利用瞬轉的方法轉入細胞中,并用Western blotting技術檢測KISS1蛋白的表達情況,用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測融合基因上游uAUGs對蛋白表達的影響。結果:通過PCR技術和Sanger測序確定GOLT1A-Kiss1基因融合事件的發(fā)生,并證實其特異性存在于SACC高轉移細胞系ACC-M的腫瘤細胞中;通過RACE等技術將融合基因的全長c DNA序列克隆出來后發(fā)現(xiàn)了融合基因的三種融合方式;用分子克隆技術成功構建了pGL3-Fusion1-KISS1-GFP、p GL3-Fusion2-KISS1-GFP、pGL3-Fusion3-KISS1-GFP、pGL3-KISS1-GFP和Fusion1-Luc、Fusion2-Luc、Fusion3-Luc、KISS1-Luc以及其融合基因uAUGs全部突變后的載體;用PCR技術和Western blotting檢測Kiss1基因的mRNA水平及內源性蛋白表達水平發(fā)現(xiàn),其在高轉移細胞系ACC-M中高mRNA水平低蛋白表達水平;雙熒光素酶實驗結果說明當把融合基因的uAUGs全部突變后熒光素酶活性上升。結論:GOLT1A-Kiss1的鑒定提供了一種新的基因融合的作用機制:即通過基因融合改變基因的5’UTR并抑制抑癌基因Kiss1的表達,從而激活癌癥發(fā)生或推動腫瘤轉移。同時,在包括涎腺腺樣囊性癌、非小細胞性肺癌、乳腺癌和肝癌的多種腫瘤模型中,GOLT1A-Kiss1的表達和腫瘤的轉移高度相關,其有希望作為多種腫瘤臨床早期診斷及藥物開發(fā)的新的靶點。
【圖文】：

圖 2.1 pMD18-T 載體圖譜Figure 2.1 pMD18-T vector map是目的片段插入位置，序列如下所示：TGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCACTGCAGGTCGACGAT （ 目 的 片 段TAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGATTAATGAA按表 2.7 所示，，16℃連接 6h表 2.7 目的片段與 T 載體連接體系Table2.7 Fragment-T vector ligation system

照第二章中 2.2.2.3 中的 PCR 產物純化方法進行便可。2.4.2 T 載體連接將純化后的幾種融合基因的全長 cDNA 按照表 2.7 的連接體系進行 T 載體，并按照 2.2.2.3 的方法進行鑒定和測序。其中鑒定時引物序列分別為 PGTGACCATGTACCAGCTGC ； P2 ： CTTTGGAACACTCCTGTAC ； P3TTATCGTGCTCCTACGC；P4: CTTGGTGAGAAGAGGCAGG，P1、P2 和 P游引物，P4 為下游引物，并以 ACC-M 的 cDNA 為模板。.3 實驗結果與討論.3.1 融合基因的鑒定及測序模 板 提 取 好 后 ， 利 用 我 們 事 先 設 計 的 引 物 GOLT1A-KISS1F1OLT1A-KISS1R1 來進行 PCR 擴增驗證融合基因的存在。擴增結果如圖 2.1 所
【學位授予單位】：湖北工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R730

【參考文獻】

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本文編號：2643084