發(fā)布時(shí)間：2020-04-26 09:26

【摘要】：紫杉醇是一種臨床上廣泛應(yīng)用的抗癌藥物。產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生菌是具有極大開(kāi)發(fā)價(jià)值的紫杉醇藥源途徑之一。但是,目前已報(bào)道的40多個(gè)屬的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌均存在紫杉醇產(chǎn)量低且不穩(wěn)定的問(wèn)題,尚無(wú)法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)�；谡婢仙即即x途徑的定向遺傳改造,是獲得紫杉醇穩(wěn)定高產(chǎn)的基因工程菌株、實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化應(yīng)用的主要途徑之一。而克隆真菌的紫杉醇合成相關(guān)基因并明晰其功能,是利用基因工程技術(shù)提高真菌紫杉醇產(chǎn)量的前提。本研究以產(chǎn)紫杉醇真菌枝狀枝孢霉(簡(jiǎn)稱:枝霉)(Cladosporium cladosporioides)MD2為研究對(duì)象,在其基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上篩選候選基因,克隆其中5個(gè)候選基因的DNA全長(zhǎng)序列并采用生物信息學(xué)方法分析其結(jié)構(gòu)和預(yù)測(cè)其功能,構(gòu)建候選基因A00981和A03231的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因菌株,分析過(guò)表達(dá)候選基因A00981和A03231對(duì)枝霉MD2紫杉烷類合成的影響,為后期深入揭示這兩個(gè)候選基因的功能以及枝霉MD2紫杉醇合成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ),同時(shí)也為紫杉醇高產(chǎn)基因工程菌株的創(chuàng)建提供基因資源。本研究主要結(jié)果如下:(1)根據(jù)枝霉MD2的基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果,尋找差異表達(dá)基因并克隆其中5個(gè)候選基因的DNA全長(zhǎng)序列,通過(guò)比對(duì)候選基因的DNA全長(zhǎng)序列和其CDS序列,發(fā)現(xiàn)候選基因A12109和A11767無(wú)內(nèi)含子,A10817和A00981各含有一個(gè)內(nèi)含子,A11450含有兩個(gè)內(nèi)含子。(2)利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)5個(gè)候選基因的潛在功能,結(jié)果顯示:數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)與候選基因A12109編碼蛋白匹配的信息,預(yù)示其可能為新基因;候選基因A11767的編碼蛋白與Ascochyta rabiei的zinc ion binding protein的一致性最高(37%);候選基因A00981編碼蛋白與Blastomyces gilchristii SLH14081的acyl-CoA dehydrogenase的一致性最高(71%);候選基因A10817編碼蛋白與Rachicladosporium antarcticum的putative aryl-alcohol dehydrogenase AAD1的一致性最高(75%);候選基因A11450編碼蛋白與Aureobasidium melanogenum CBS 110374的S-2-hydroxy-acid oxidase的一致性最高(59%)。(3)構(gòu)建候選基因A00981的過(guò)表達(dá)載體,并采用農(nóng)桿菌AGL-1介導(dǎo)轉(zhuǎn)化枝霉MD2,共獲得13株pTFCM-A00981轉(zhuǎn)基因菌株。Southern blot檢測(cè)結(jié)果表明,5株轉(zhuǎn)基因菌株(編號(hào)為ZB、ZC、ZF、ZH和ZL)的外源基因?yàn)閱慰截惙绞秸�。QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因菌株ZC中候選基因A00981的表達(dá)量最高,是對(duì)照(未轉(zhuǎn)基因枝霉MD2)菌株的2.0倍。HPLC檢測(cè)結(jié)果表明,相對(duì)于對(duì)照菌株的紫杉醇(1.06±0.02μg/mL)、巴卡亭III(2.62±0.05μg/mL)和10-去乙酰巴卡亭III(2.55±0.05μg/mL)產(chǎn)量,A00981-轉(zhuǎn)基因菌株ZC中的紫杉醇(1.05±0.02μg/mL)、巴卡亭III(2.69±0.05μg/mL)和10-去乙酰巴卡亭III(2.46±0.05μg/mL)產(chǎn)量均無(wú)明顯變化,初步說(shuō)明過(guò)表達(dá)候選基因A00981對(duì)枝霉MD2的紫杉醇、巴卡亭III及10-去乙酰巴卡亭III的合成無(wú)明顯影響。(4)構(gòu)建候選基因A03231的過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化枝霉MD2,共獲得9株pTFCM-A03231轉(zhuǎn)基因菌株。Southern blot檢測(cè)結(jié)果表明,5株轉(zhuǎn)基因菌株(編號(hào)為XA、XF、XG、XH和XI)的外源基因以單拷貝方式整合到宿主基因組。QRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因菌株XH中候選基因A03231的表達(dá)量最高,是對(duì)照菌株的2.0倍。HPLC檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照菌株相比,A03231-轉(zhuǎn)基因菌株XH中紫杉醇(0.99±0.02μg/mL)和巴卡亭III(2.64±0.05μg/mL)的產(chǎn)量無(wú)明顯變化,10-去乙酰巴卡亭III(1.59±0.03μg/mL)的產(chǎn)量降低了37.6%,初步說(shuō)明過(guò)表達(dá)候選基因A03231對(duì)枝霉MD2的紫杉醇和巴卡亭III的合成無(wú)明顯影響,但降低了10-去乙酰巴卡亭III的產(chǎn)量。
【圖文】：

00981、A10817 和 A11450 作為候選基因進(jìn)行后續(xù)研究（圖2.1）。用 SDS-CTAB 法提取枝霉 MD2 的基因組 DNA，測(cè)得其濃度約為 500 ng/μL，瓊脂

DNA 序列為 912 bp，無(wú)內(nèi)含子；候選基因 A00981 的 DNA 序列為 9694 bp，有 1 個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子長(zhǎng) 79 bp，區(qū)間為（455，531）；候選基 序列為 854 bp，，cDNA 序列為 744 bp，有 1 個(gè)內(nèi)含子，內(nèi)含子長(zhǎng) 1，323）；候選基因 11450 的 DNA 序列為 1287bp，cDNA 序列為 1，內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為 106 bp、77 bp，區(qū)間分別為（131，238）和（）。M 1 4M1235
【學(xué)位授予單位】：中南民族大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳剛;周謙;王e

本文編號(hào)：2641346