發(fā)布時(shí)間：2020-04-23 08:01

【摘要】：本研究以miR-18a-5p和miR-802為研究對(duì)象,檢測過表達(dá)miR-18a-5p和miR-802模擬物對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、凋亡的影響作用,預(yù)測mi R-18a-5p和miR-802可能調(diào)控的靶基因。通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn),qRT-PCR等方法驗(yàn)證miR-18a-5p和miR-802及其靶基因之間的相互作用關(guān)系;構(gòu)建過表達(dá)microRNA的瞬時(shí)真核表達(dá)載體,分析過表達(dá)miR-18a-5p和miR-802及其調(diào)控靶基因參與的信號(hào)通路的影響,討論miR-18a-5p和miR-802對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。1.本研究中利用Lipofectamin?3000轉(zhuǎn)染試劑經(jīng)脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)將過表達(dá)miR-18a-5p和miR-802模擬物轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞,檢測轉(zhuǎn)染后在不同時(shí)間24h、48h、72h內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率;實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR結(jié)果顯示:成功建立瞬時(shí)過表達(dá)miR-18a-5p和miR-802的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞模型;在48h達(dá)到高峰,過表達(dá)miR-18a-5p和miR-802模擬物轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為57.38±8.38,24.62±4.22;利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測過表達(dá)miR-18a-5p-eGFP組、NC-eGFP組、空白對(duì)照組轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞在不同濃度模擬物(質(zhì)粒DNA)50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL和200μg/mL在不同時(shí)間12h、24h、48h及72h內(nèi)對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長所產(chǎn)生的增殖抑制作用,MTT檢測結(jié)果顯示質(zhì)粒DNA濃度為200μg/mL時(shí)抑制作用比較好,過表達(dá)miR-18a-5p模擬物顯著抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖,增殖抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性。質(zhì)粒DNA濃度為200μg/mL轉(zhuǎn)染時(shí)間12h、24h、48h及72h內(nèi)的增殖抑制率分別為26.80%、46.37%、66.02%及74.66%;不同濃度在不同時(shí)間12h、24h、48h和72h內(nèi)有顯著性差異(P0.05)。2.通過Annexin V-PE/7-AAD雙染色法,用流式細(xì)胞儀檢測過表達(dá)miR-18a-5p-eGFP組、陰性對(duì)照NC-eGFP組在不同時(shí)間24h、48h、72h內(nèi)轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞后的凋亡率。結(jié)果表明,過表達(dá)miR-18a-5p模擬物(miR-18a-5p-eGFP)轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌SW480細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡時(shí)間依賴性。最后應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR方法,以β-actin作為內(nèi)參對(duì)照轉(zhuǎn)染后的SW480細(xì)胞總RNA,qRT-PCR法檢測mRNA為模板檢測出DUSP5、FZD3及CCND2基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果顯示:DUSP5和FZD3基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)表達(dá),差異表達(dá)倍數(shù)分別為2.15、1.74(2~(-△△Ct)比較P0.01),而且CCND2基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)表達(dá),差異表達(dá)倍數(shù)為0.62(2~(-△△Ct)比較P0.01),實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,過表達(dá)mi R-18a-5p對(duì)SW480細(xì)胞具有增殖抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用,機(jī)制可能過表達(dá)miR-18a-5p通過MAPK、Wnt和PI3K-AKT信號(hào)通路靶向調(diào)控DUSP5、FZD3基因的上調(diào)表達(dá)及CCND2基因的下調(diào)表達(dá)有關(guān)。3.miR-802調(diào)控的靶基因HSPA6、TCF7L2及NKD1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平;qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:NKD1、HSPA6靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)表達(dá),差異表達(dá)倍數(shù)分別為4.22、3.17(2~(-△△Ct)比較P0.01),而且TCF7L2基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)表達(dá),差異表達(dá)倍數(shù)為0.25(2~(-△△Ct)比較P0.01);本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與靶基因芯片結(jié)果一致,各基因mRNA表達(dá)的改變趨勢(shì)符合前期芯片結(jié)果,進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果的精準(zhǔn)程度。miR-18a-5p和miR-802在人結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起抑癌作用,因此miR-18a-5p、miR-802是治療人結(jié)腸癌的重要分子靶點(diǎn)。
【圖文】：

篩選出靶基因。體及質(zhì)粒 DNA 抽提熟 miRNA 序列，按照 Hsa-miR-18a-5p72 ） 的 成 熟 miRNA 序 列 ：G-3`，，設(shè)計(jì)合成帶有末端保護(hù)堿基、sa-miR-18a-5p 引 物 。 引 物 序 列 ：：AATCTACTGCAGTGAAGGCACTTG-3ATCCGGTGGATCCGTGCAACTATGC-18a-5p 序 列 ， 構(gòu) 建 真 核 過 表 達(dá)（ miR-18a-5p-eGFP) 、 插 入 空 載 體3` ） 的 陰 性 對(duì) 照質(zhì) 粒

MIMAT0004185）的成熟 miRNA 序列：U-3`；Hsa-miR-802-pGV251-EGFP 質(zhì)粒CTCCGAACGTGTCACGT-3′）的陰性對(duì)in 質(zhì)粒（SV40-NC-eGFP），設(shè)計(jì)合成帶位點(diǎn)的 Hsa-miR-802 引物。引物序列：GACGCGGGATCTGTTTCTCTGCAGCR:5`-CAGCGGTTTAAACTTAAGCTAA 將 miR-18a-5p-eGFP 、 NC-eGFP 和 50 mg/mL 卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基中，220粒小體試劑盒說明書抽提真核 miRNA 質(zhì)NA 濃度和純度合格，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
【學(xué)位授予單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R735.35

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本文編號(hào)：2637525