發(fā)布時間：2020-04-23 08:01

【摘要】：本研究以miR-18a-5p和miR-802為研究對象,檢測過表達(dá)miR-18a-5p和miR-802模擬物對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、凋亡的影響作用,預(yù)測mi R-18a-5p和miR-802可能調(diào)控的靶基因。通過雙熒光素酶實驗,qRT-PCR等方法驗證miR-18a-5p和miR-802及其靶基因之間的相互作用關(guān)系;構(gòu)建過表達(dá)microRNA的瞬時真核表達(dá)載體,分析過表達(dá)miR-18a-5p和miR-802及其調(diào)控靶基因參與的信號通路的影響,討論miR-18a-5p和miR-802對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。1.本研究中利用Lipofectamin?3000轉(zhuǎn)染試劑經(jīng)脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將過表達(dá)miR-18a-5p和miR-802模擬物轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞,檢測轉(zhuǎn)染后在不同時間24h、48h、72h內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率;實時熒光定量qRT-PCR結(jié)果顯示:成功建立瞬時過表達(dá)miR-18a-5p和miR-802的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞模型;在48h達(dá)到高峰,過表達(dá)miR-18a-5p和miR-802模擬物轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中的相對表達(dá)量分別為57.38±8.38,24.62±4.22;利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測過表達(dá)miR-18a-5p-eGFP組、NC-eGFP組、空白對照組轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細(xì)胞在不同濃度模擬物(質(zhì)粒DNA)50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL和200μg/mL在不同時間12h、24h、48h及72h內(nèi)對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長所產(chǎn)生的增殖抑制作用,MTT檢測結(jié)果顯示質(zhì)粒DNA濃度為200μg/mL時抑制作用比較好,過表達(dá)miR-18a-5p模擬物顯著抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖,增殖抑制作用呈劑量和時間依賴性。質(zhì)粒DNA濃度為200μg/mL轉(zhuǎn)染時間12h、24h、48h及72h內(nèi)的增殖抑制率分別為26.80%、46.37%、66.02%及74.66%;不同濃度在不同時間12h、24h、48h和72h內(nèi)有顯著性差異(P0.05)。2.通過Annexin V-PE/7-AAD雙染色法,用流式細(xì)胞儀檢測過表達(dá)miR-18a-5p-eGFP組、陰性對照NC-eGFP組在不同時間24h、48h、72h內(nèi)轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞后的凋亡率。結(jié)果表明,過表達(dá)miR-18a-5p模擬物(miR-18a-5p-eGFP)轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌SW480細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡時間依賴性。最后應(yīng)用實時熒光定量qRT-PCR方法,以β-actin作為內(nèi)參對照轉(zhuǎn)染后的SW480細(xì)胞總RNA,qRT-PCR法檢測mRNA為模板檢測出DUSP5、FZD3及CCND2基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果顯示:DUSP5和FZD3基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)表達(dá),差異表達(dá)倍數(shù)分別為2.15、1.74(2~(-△△Ct)比較P0.01),而且CCND2基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)表達(dá),差異表達(dá)倍數(shù)為0.62(2~(-△△Ct)比較P0.01),實驗結(jié)果提示,過表達(dá)mi R-18a-5p對SW480細(xì)胞具有增殖抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用,機(jī)制可能過表達(dá)miR-18a-5p通過MAPK、Wnt和PI3K-AKT信號通路靶向調(diào)控DUSP5、FZD3基因的上調(diào)表達(dá)及CCND2基因的下調(diào)表達(dá)有關(guān)。3.miR-802調(diào)控的靶基因HSPA6、TCF7L2及NKD1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平;qRT-PCR實驗結(jié)果顯示:NKD1、HSPA6靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)表達(dá),差異表達(dá)倍數(shù)分別為4.22、3.17(2~(-△△Ct)比較P0.01),而且TCF7L2基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)表達(dá),差異表達(dá)倍數(shù)為0.25(2~(-△△Ct)比較P0.01);本實驗數(shù)據(jù)與靶基因芯片結(jié)果一致,各基因mRNA表達(dá)的改變趨勢符合前期芯片結(jié)果,進(jìn)一步驗證芯片結(jié)果的精準(zhǔn)程度。miR-18a-5p和miR-802在人結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中起抑癌作用,因此miR-18a-5p、miR-802是治療人結(jié)腸癌的重要分子靶點。
【圖文】：

篩選出靶基因。體及質(zhì)粒 DNA 抽提熟 miRNA 序列，按照 Hsa-miR-18a-5p72 ） 的 成 熟 miRNA 序 列 ：G-3`，，設(shè)計合成帶有末端保護(hù)堿基、sa-miR-18a-5p 引 物 。 引 物 序 列 ：：AATCTACTGCAGTGAAGGCACTTG-3ATCCGGTGGATCCGTGCAACTATGC-18a-5p 序 列 ， 構(gòu) 建 真 核 過 表 達(dá)（ miR-18a-5p-eGFP) 、 插 入 空 載 體3` ） 的 陰 性 對 照質(zhì) 粒

MIMAT0004185）的成熟 miRNA 序列：U-3`；Hsa-miR-802-pGV251-EGFP 質(zhì)粒CTCCGAACGTGTCACGT-3′）的陰性對in 質(zhì)粒（SV40-NC-eGFP），設(shè)計合成帶位點的 Hsa-miR-802 引物。引物序列：GACGCGGGATCTGTTTCTCTGCAGCR:5`-CAGCGGTTTAAACTTAAGCTAA 將 miR-18a-5p-eGFP 、 NC-eGFP 和 50 mg/mL 卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基中，220粒小體試劑盒說明書抽提真核 miRNA 質(zhì)NA 濃度和純度合格，可用于后續(xù)實驗。
【學(xué)位授予單位】：新疆大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R735.35

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 萬曉龍;趙楠;景鵬瑞;魯曉嵐;董水瀅;史海濤;;miR-125a-3p調(diào)控人結(jié)腸癌細(xì)胞浸潤轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2018年07期

2 尹宜海;劉霞;張守成;;華蟾素聯(lián)合三氧化二砷對結(jié)腸癌細(xì)胞的作用[J];江蘇醫(yī)藥;2017年15期

3 王立明,鄭靈,秦榮,張朝軍,馬丹,向佳梅;結(jié)腸癌細(xì)胞中氧自由基含量的臨床測定[J];重慶醫(yī)學(xué);2005年02期

4 樊代明,張學(xué)庸,陳希陶,胡家露,牟震先,陳寶軍,喬太東,朱明華,楊鴻兵,楊振東;抗結(jié)腸癌細(xì)胞單克隆抗體的制備及相應(yīng)抗原免疫組化鑒定[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1988年02期

5 周進(jìn)明;周琪;彭秋平;楊黎;李紅梅;梁后杰;;糖皮質(zhì)激素受體β表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞激素敏感相關(guān)性的實驗觀察[J];中華腫瘤防治雜志;2010年05期

6 張朝陽;徐克森;楊廣運;王金申;高穎;劉炎峰;帥晶;王家勇;李少燕;壽楠海;牛軍;;反義整合素β6基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞作用的研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2007年37期

7 鄭見寶;祁杰;王訓(xùn)凱;李孝彬;王孝瓏;陳南征;余鈞輝;韓陽;孫學(xué)軍;;下調(diào)尾型同源盒基因-2對結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲及遷移能力的影響及其機(jī)制[J];西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2017年04期

8 蔡文杰;王艷;隨力;王銘潔;;硫化氫促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長[J];中國藥理學(xué)通報;2014年12期

9 田永剛;許軍;劉昶;;人工氣腹對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J];腹腔鏡外科雜志;2009年10期

10 林潔;黃瓊;來茂德;;5-氮-2′-脫氧胞苷對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[J];臨床與實驗病理學(xué)雜志;2008年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 許峰;王杉;葉穎江;崔志榮;;腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞在結(jié)腸癌細(xì)胞殺傷中的作用及機(jī)制[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國消化病學(xué)術(shù)會議論文匯編（下冊）[C];2007年

2 王貴玉;王錫山;;激光捕獲微切割技術(shù)分離結(jié)腸癌細(xì)胞用于蛋白組學(xué)研究[A];中國蛋白質(zhì)組學(xué)第三屆學(xué)術(shù)大會論文摘要[C];2005年

3 何向鋒;王建紅;譚清和;徐小紅;陸俊國;楊磊;沈茜;徐薇薇;凌國杰;江棋;;肝竇內(nèi)皮細(xì)胞攝取結(jié)腸癌細(xì)胞來源外泌體的熒光示蹤研究[A];第八屆中國腫瘤學(xué)術(shù)大會暨第十三屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2014年

4 郭俊明;賴依峰;肖丙秀;劉瓊;;大豆異黃酮對體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的影響[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會2003年學(xué)術(shù)交流會論文摘要集[C];2003年

5 沈丹;鄧長生;;過氧化物酶體增殖物激活受體γ在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其激動劑對結(jié)腸癌細(xì)胞的生長抑制作用[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國消化病學(xué)術(shù)會議論文匯編（下冊）[C];2007年

6 吳寒;王建春;汪玉霞;陳鵬宇;歐陽靜萍;;γδT細(xì)胞對結(jié)腸癌細(xì)胞的作用研究[A];第十四屆全國腫瘤生物治療大會論文集[C];2015年

7 陳旭;林志烽;席文錦;王微;霍毅;楊安鋼;王濤;;MicroRNA-487b調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、遷移及其機(jī)制研究[A];第十二屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會摘要匯編[C];2017年

8 王國強(qiáng);方m錁

本文編號：2637525