【摘要】：研究背景:盡管靜脈溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)、冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架置入等心臟再灌注治療,可以顯著提高患者的存活率,但缺血心肌在恢復(fù)血流灌注過程中,會(huì)出現(xiàn)再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI).心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制尚未完全明白,但如何防治再灌注損傷一直成為心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類具有基因調(diào)節(jié)功能的內(nèi)源性非編碼小分子RNA,可以通過識(shí)別3端非編碼區(qū)(3'-uncoding region,3'URT)與其靶向信使RNA(message RNA,mRNA)相結(jié)合,降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻譯,降低蛋白表達(dá)水平。在占據(jù)人類全基因組98.5%的非編碼RNA中,絕大多數(shù)被轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)度大于200nt的 RNA 分子,由此稱為長(zhǎng)鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA,LncRNA。LncRNA在多個(gè)層面上參與細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育等重要生命過程的調(diào)節(jié),并與人類的重大疾病密切相關(guān)。在前期相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),通過生物信息學(xué)對(duì)GSE50378芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析中,LncRNA-AK123483基因在A/R心肌細(xì)胞中異常表達(dá)。因此認(rèn)為,LncRNA-AK123483與心肌缺血再灌注損傷過程存在著密切聯(lián)系,但在心肌缺血再灌注損傷中是如何參與調(diào)控機(jī)制的過程,正是本研究關(guān)注的問題。因此,我們擬通過利用大鼠心肌細(xì)胞(H9c2)構(gòu)建缺氧/復(fù)氧模型,研究LncRNA-AK123483和心肌缺血再灌注損傷相關(guān)基因(PARP、caspase-3)的相互作用關(guān)系,從而明確LncRNA-AK123483在心肌缺血再灌注損傷過程中的調(diào)控機(jī)制。研究方法:在NCBI-GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得lncRNA-mRNA芯片表達(dá)譜GSE50378和GSE22282,并通過R軟件包(EdgeR)對(duì)處理組和對(duì)照組的lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行差異表達(dá)分析,經(jīng)過篩選和兩組表達(dá)譜比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)LncRNA-AK123483基因異常表達(dá),因此,挑選LncRNA-AK123483作為本次研究的對(duì)象。應(yīng)用qRT-PCR的方法在正常組、缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。采用siRNA干擾技術(shù)干擾LncRNA-AK123483的表達(dá)后,比較分析正常組與缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞中乳酸脫氫酶(LDH)的活性及細(xì)胞的凋亡情況。最后通過Western blot方法檢測(cè)PARP(多聚ADP核糖聚合酶)和Caspase-3基因的表達(dá)水平。結(jié)果:在本次研究中,從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了 gse50378和gse22282兩組芯片數(shù)據(jù)并對(duì)篩選其差異表達(dá)基因。其中,GSE50378芯片數(shù)據(jù)中,lncRNAak123483的差異表達(dá)倍數(shù)最顯著,因此挑選LncRNA-AK123483用于后續(xù)的研究。與正常心肌細(xì)胞相比,A/R(缺氧、復(fù)氧)心肌細(xì)胞中的LncRNA-AK123483表達(dá)水平、LDH酶的活性和細(xì)胞凋亡程度均顯著提高。經(jīng)對(duì)A/R(缺氧、復(fù)氧)心肌細(xì)胞與正常細(xì)胞的LncRNA-AK123483干擾處理并對(duì)LDH的活性及細(xì)胞凋亡程度進(jìn)行檢測(cè)和分析,結(jié)果表明,A/R(缺氧、復(fù)氧)心肌細(xì)胞中的LDH的活性及細(xì)胞凋亡程度顯著降低,但在正常細(xì)胞中的LDH的活性及細(xì)胞凋亡程度并無顯著變化。乳酸脫氫酶(LDH)一直被認(rèn)為是血管內(nèi)溶血中重要的臨床指標(biāo)。它存在于癌癥患者的血清中,可作為胰腺癌、骨肉瘤、腎癌或睪丸癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。LDH-5酶可以催化人體內(nèi)丙酮酸與乳酸之間的轉(zhuǎn)換,在厭氧條件下細(xì)胞代謝中扮演著非常重要的作用。此外,LDH-5在非小細(xì)胞肺癌中,它與腫瘤缺氧、血管形成因子的生成和預(yù)后不良有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,缺氧和復(fù)氧(A/R)可以提高LDH的含量,但是經(jīng)敲除lincRNA AK123483后可以降低LDH的含量。通過Western blot方法對(duì)LncRNA-AK123483干擾前后的PARP(多聚ADP核糖聚合酶)、Caspase-3基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)和分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在干擾前,A/R(缺氧、復(fù)氧)心肌細(xì)胞中的PARP(多聚ADP核糖聚合酶)、Caspase-3基因的表達(dá)水平顯著高于正常細(xì)胞;相反,經(jīng)LncRNA-AK123483干擾后,A/R(缺氧、復(fù)氧)心肌細(xì)胞中的PARP(多聚ADP核糖聚合酶)、Caspase-3基因的顯著降低。PARP(多聚ADP核糖聚合酶)負(fù)責(zé)應(yīng)對(duì)許多內(nèi)源性和環(huán)境遺傳毒性藥物蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。它是一種保守的核蛋白,它能迅速、直接結(jié)合和剪切單鏈和雙鏈DNA。PARP基因存在于多數(shù)真核細(xì)胞中的多功能性蛋白,可以識(shí)別受損的DNA缺口而被激活從而對(duì)DNA進(jìn)行修復(fù)和參與細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)過程,如DNA修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞死亡、染色質(zhì)功能和基因組穩(wěn)定性。PARP-1參與DNA修復(fù)和DNA損傷激活。抑制PARP-1可能通過激活SIRT1增加線粒體代謝。細(xì)胞凋亡存在于許多生物學(xué)過程中,在腫瘤、神經(jīng)退化性疾病中起到了至關(guān)重要的作用。Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白酶。在程序性細(xì)胞死亡過程中,caspase-3的激活導(dǎo)致DNA修復(fù)蛋白、細(xì)胞骨架蛋白的降解。Caspase-3激活ROCK-1在心肌細(xì)胞凋亡中起著重要的作用。結(jié)論:研究結(jié)果表明,LncRNA-AK123483的上調(diào)表達(dá)促進(jìn)了心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生。LncRNA-AK123483的敲除影響PARP和caspase-3基因的表達(dá),從而對(duì)因缺血再灌注導(dǎo)致的受損心肌細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)和保護(hù)作用。這可為減輕心肌缺血再灌注損傷的治療中提供一種新的思路和方法。在本次研究中,在A/R處理組中l(wèi)ncRNA-AK12383基因的敲除引起心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低,但在對(duì)照組中敲除LncRNA-AK123483對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡情況并無顯著影響。由此說明,LncRNA-AK123483基因可能參與了缺氧/復(fù)氧等外界應(yīng)激因素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑,而不參與細(xì)胞程序性死亡的過程。我們只考察了 LncRNA-AK123483對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的作用,LncRNA-AK123483對(duì)心肌細(xì)胞遷移的影響還需要進(jìn)一步探索。在本次研究中該發(fā)現(xiàn)了 一些非常重要的分子標(biāo)記物,如:Ki-67、Caspase6、Bax、Bcl-2、Bax X1等標(biāo)志物,在今后的研究中我們將會(huì)對(duì)以上標(biāo)記物進(jìn)行功能驗(yàn)證,并分析其在缺血再灌注損傷發(fā)生過程中的作用。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,長(zhǎng)鏈非編碼RNA AK123483可能是心肌缺血再灌注損傷潛在的治療靶標(biāo)。
【圖文】：

浙江大學(xué)博士學(xué)位論文邐結(jié)果與分析逡逑２、ＧＳＥ５０３７８和ＧＳＥ２２２８２的差異表達(dá)ＬｎｃＲＮＡ熱圖制作逡逑從熱圖中可以明顯看出，在ＧＳＥ２２２８２芯片數(shù)據(jù)中，共篩到了具有代表性的異逡逑常表達(dá)ＩｎｃＲＮＡ共有６５個(gè)，其中有３０下調(diào)表達(dá)和３５個(gè)上調(diào)表達(dá)的ＩｎｃＲＮＡ。在逡逑ＧＳＥ５０３７８芯片數(shù)據(jù)中，共篩選到了邋２６個(gè)共差異表達(dá)的ＬｎｃＲＮＡ，其中包括８?jìng)�(gè)上逡逑調(diào)表達(dá)ＬｎｃＲＮＡ，邋１８?jìng)�(gè)顯著下調(diào)表達(dá)的ＬｎｃＲＮＡ。在ＧＳＥ５０３７８芯片數(shù)據(jù)中，逡逑ＬｎｃＲＮＡ－ＡＫ２４８９８、ＬｎｃＲＮＡ－ＡＫ１２３４８３、ＬｎｃＲＮＡ－ＡＫ８９９４０邋差異表達(dá)最為顯著，，逡逑說明這些ＬｎｃＲＮＡ可能起著最為重要的作用。此外，在ＧＳＥ２２２８２芯片數(shù)據(jù)中，逡逑ＬｎｃＲＮＡ－ＡＹ２１６２６５、ＬｎｃＲＮＡ－ＢＣ０４０８３４、ＬｎｃＲＮＡ－ＡＢＯ邋１９５６２邋，邋ＬｎｃＲＮＡ－逡逑ＢＣ０２４０２０、ＬｎｃＲＮＡ－ＡＫ０２３３３０等在ＧＳＥ２２２８２芯片數(shù)據(jù)中異常上調(diào)表達(dá)，其中差逡逑異表達(dá)倍數(shù)最高達(dá)ｌ0ｇ［ＦＣ］＝２．逡逑ＧＳＥ５０３７８邐邐邋ＧＳＥ２２２８２逡逑＂

Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ＧＯ邋ａｎｄ邋ＫＥＧＧ邋ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ邋ｉｎ邋ＧＳＥ５０３７８邋ｔｈａｔ邋ｗａｓ逡逑ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｇｅｎｅｓ．逡逑注：圖２－Ａ代表差異表達(dá)基因ＧＯ富集結(jié)果，圖２－Ｂ代表差異表達(dá)基因ＫＥＧＧ代逡逑謝通路富集結(jié)果。從ＧＯ富集的結(jié)果中看：共有１１條Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋Ｐｒｏｃｅｓｓ、７條逡逑Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎ；４條Ｃｅｌｌｕ丨ａｒＣｏｍｐｏｎｅｎｔ；這些差異表達(dá)基因所富集到的ＧＯ逡逑和ＫＥＧＧ代謝通路的信息，見附表３和附表４。逡逑（２）在ＧＳＥ５０３７８的ＤＥＧｓ的ＧＯ富集結(jié)果如圖３和附表１所示。在ＧＯ富集逡逑的通路中共富集到了邋４５邋條邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎ、１２７邋條邋Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋Ｐｒｏｃｅｓｓ邋和邋３２邋條逡逑Ｃｅｌｌｕｌａｒ邋Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ條目。在Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎ功能項(xiàng)中，ＤＥＧｓ主要富集在分子逡逑功能、胞外空間、細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞表面、質(zhì)膜的整體組分等等；在Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋Ｐｒｏｃｅｓｓ逡逑功能項(xiàng)中：ＤＥＧｓ主要富集在炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑、逡逑信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞間傳遞、正面調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等等
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R542.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳e

本文編號(hào)：2637250