發(fā)布時(shí)間：2020-04-22 15:24

【摘要】：目的與背景:乳腺癌是影響全世界女性健康的惡性腫瘤類(lèi)型之一。其患者多因腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移而引起的并發(fā)癥而死亡,這需要更好地理解導(dǎo)致疾病進(jìn)展的生物學(xué)基礎(chǔ),從而發(fā)現(xiàn)減緩其生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的新方法。最近的研究表明,mi R-193b在多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著重要的抑制作用,并且與患者的臨床病理特征和預(yù)后聯(lián)系緊密。RAB22A是原癌基因RAS家族的成員,在外泌體的形成,運(yùn)輸和代謝中起重要作用,并且與多種人類(lèi)癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān),但其在乳腺癌中具體的作用機(jī)制仍不清楚。外泌體是由細(xì)胞產(chǎn)生并分泌至細(xì)胞外的微囊泡,依靠其內(nèi)含有的特殊遞質(zhì)成分在細(xì)胞之間傳遞特殊的生物信號(hào),從而影響到腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。在本文中我們將通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞與組織中RAB22A基因與mi R-193b的表達(dá)水平,明確在不同樣本中二者表達(dá)水平間的相互關(guān)系;探討調(diào)控RAB22A表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用及與mi R-193b的關(guān)系;研究RAB22A基因所介導(dǎo)的外泌體產(chǎn)生與發(fā)揮功能在乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中所起到的作用。這些研究可能對(duì)乳腺癌的靶向治療方式的選擇具有一定意義。方法:檢測(cè)RAB22A與mi R-193b的表達(dá):收集242例浸潤(rùn)性乳腺癌患者的組織,以及乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3、MDA-MB-453、MDA-MB-468、ZR-75、T47D和乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A,通過(guò)RT-q PCR及免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn),檢測(cè)RAB22A與mi R-193b的表達(dá)水平及相對(duì)關(guān)系。此外,用免疫組織化學(xué)技術(shù)分析這部分患者癌組織內(nèi)RAB22A的表達(dá)水平,探討其與患者年齡、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等乳腺癌預(yù)后影響因素間的關(guān)系。利用Kaplan-Meier生存曲線評(píng)價(jià)高表達(dá)RAB22A基因?qū)颊哳A(yù)后的影響能力。建立低表達(dá)RAB22A基因的細(xì)胞模型:分別建立mi R-193b過(guò)表達(dá)的MCF-7和SK-BR-3細(xì)胞模型,利用RT-q PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞中mi R-193b的表達(dá),證實(shí)轉(zhuǎn)染效果;同時(shí)觀察過(guò)表達(dá)mi R-193b后對(duì)于RAB22A的影響。在過(guò)表達(dá)mi R-193b的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染去除了mi R-193b結(jié)合位點(diǎn)的pc DNA3.1-RAB22A或pc DNA3.1,觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,證實(shí)RAB22A與mi R-193b的調(diào)節(jié)關(guān)系;使用克隆有HBLV-RAB22A sh RNA-Puro(sh RAB22A)的慢病毒感染MCF-7和SK-BR-3細(xì)胞,HBLV-Scramble-Puro control(SC)用于陰性對(duì)照,利用RT-q PCR及免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)RAB22A基因的敲減效果。外泌體的提取與酶處理:分別收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)上清液,在4℃進(jìn)行2次110,000g,各70分鐘的超高速離心,PBS溶液重懸沉淀,提取外泌體進(jìn)行分析。從SK-BR-3細(xì)胞所提取的外泌體使用蛋白酶及RNA酶對(duì)其內(nèi)所含的蛋白及RNA進(jìn)行滅活用于去除外泌體。外泌體攝取實(shí)驗(yàn):被Di O探針標(biāo)記的外泌體與SK-BR-3細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí),PBS沖洗后,用4%多聚甲醛固定15分鐘,并在室溫下用DAPI染色細(xì)胞核5分鐘。放置于熒光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。外泌體與細(xì)胞的共育實(shí)驗(yàn):MCF-7、SK-BR-3細(xì)胞中加入待實(shí)驗(yàn)的外泌體至其終濃度達(dá)到20μg/ml,放置于37℃,5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)2天后,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):觀察低表達(dá)RAB22A基因或與外泌體共育后對(duì)MCF-7或SK-BR-3細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響。克隆形成實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)敲減RAB22A基因?qū)CF-7或SK-BR-3細(xì)胞增殖能力的作用。使用Transwell細(xì)胞遷移與浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)敲減RAB22A基因或去除外泌體后,對(duì)SK-BR-3細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響。結(jié)果:1.人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞與組織中RAB22A基因與mi R-193b的表達(dá):本研究證明了高表達(dá)RAB22A基因與乳腺癌進(jìn)展和腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),并提示臨床預(yù)后不良。通過(guò)檢測(cè)RAB22A基因和mi R-193b的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞與組織中RAB22A基因水平與蛋白含量均升高,尤其在腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中,其增高程度最為明顯,且RAB22A基因和mi R-193b的表達(dá)水平在癌細(xì)胞或癌組織內(nèi)與乳腺上皮細(xì)胞或正常乳腺組織的相反。2.過(guò)表達(dá)mi R-193b與RAB22A基因的關(guān)系:轉(zhuǎn)染mi R-193b后,在MCF-7和SK-BR-3細(xì)胞內(nèi),相較對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組mi R-193b的表達(dá)水平升高至~8倍和~10倍,而RAB22A基因表達(dá)降低~60%和~80%,同時(shí)RAB22A蛋白的含量降低至~40%和~30%。3.RAB22A基因與乳腺癌細(xì)胞增殖的關(guān)系:在轉(zhuǎn)染了去除mi R-193b結(jié)合位點(diǎn)的RAB22A基因的過(guò)表達(dá)mi R-193b的細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)mi R-193b與RAB22A的SK-BR-3細(xì)胞的增殖情況恢復(fù)到與陰性對(duì)照組細(xì)胞持平,顯著強(qiáng)于單獨(dú)轉(zhuǎn)染mi R-193b的實(shí)驗(yàn)組;而單獨(dú)過(guò)表達(dá)RAB22A,對(duì)SK-BR-3細(xì)胞的增殖能力的促進(jìn)作用則明顯高于陰性對(duì)照組。4.敲減RAB22A基因與乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的關(guān)系:在MCF-7和SK-BR-3細(xì)胞中敲減RAB22A后,RAB22A表達(dá)水平降低至對(duì)照細(xì)胞的~30%和~35%,RAB22A蛋白含量降低至~50%和~20%。將過(guò)表達(dá)mi R-193b或敲減RAB22A的SK-BR-3細(xì)胞培養(yǎng)至第三天,發(fā)現(xiàn)低表達(dá)RAB22A基因即失去了對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用,該現(xiàn)象隨天數(shù)的增加而愈加顯著;而在MCF-7細(xì)胞中,低表達(dá)RAB22A基因失去對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用在第四天以后即有明顯的表現(xiàn)。此外,MCF-7和SK-BR-3細(xì)胞在敲減RAB22A基因后克隆形成數(shù)量為陰性對(duì)照組克隆形成數(shù)量的~20%和~30%。并且,低表達(dá)RAB22A基因能夠使SK-BR-3細(xì)胞遷移的能力降低~55%,侵襲的能力降低~40%。5.RAB22A基因與外泌體的關(guān)系:對(duì)比于陰性對(duì)照細(xì)胞,低表達(dá)RAB22A基因使貼合在SK-BR-3細(xì)胞的外泌體信號(hào)減少,此外可以發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組外泌體內(nèi)的標(biāo)記蛋白TSG101及載質(zhì)蛋白HSP70的含量均出現(xiàn)降低,而在細(xì)胞的總蛋白提取物中,這一現(xiàn)象并未被觀測(cè)到。6.受RAB22A基因調(diào)節(jié)的外泌體對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響:將外泌體與細(xì)胞共培養(yǎng)至第三天后,可以發(fā)現(xiàn)額外添加陰性對(duì)照組細(xì)胞所分泌的外泌體能夠恢復(fù)低表達(dá)RAB22A基因?qū)K-BR-3細(xì)胞增殖能力的影響,而在對(duì)這部分外泌體進(jìn)行酶處理后,恢復(fù)細(xì)胞增殖能力的作用消失。同樣,由低表達(dá)RAB22A基因的細(xì)胞所分泌的外泌體也失去恢復(fù)細(xì)胞增殖能力的作用。相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以在MCF-7細(xì)胞中得到重復(fù)。敲減RAB22A基因的SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞,與添加未被酶處理外泌體共培養(yǎng)的細(xì)胞相比照,去除外泌體內(nèi)的蛋白與RNA成分后,促進(jìn)細(xì)胞遷移的能力失去了~40%,促進(jìn)侵襲的能力失去了~30%。結(jié)論:1.RAB22A基因的表達(dá)上調(diào)與乳腺腫瘤形成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),可作為提示乳腺癌臨床預(yù)后水平的標(biāo)志物之一。2.mi R-193b通過(guò)靶向調(diào)控RAB22A基因的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。3.RAB22A基因具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的能力,而此能力可能與其調(diào)節(jié)外泌體的合成與分泌有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：2636657