【摘要】：腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor-associated factors,TRAF)等信號分子介導(dǎo)信號傳導(dǎo)通路參與宿主免疫防御,炎癥,環(huán)境應(yīng)激等生物過程。為了進(jìn)一步研究其免疫功能,本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選出馬氏珠母貝腫瘤壞死因子受體及其相關(guān)因子關(guān)健基因,并進(jìn)行基因克隆、組織定量、免疫刺激、基因沉默后的表達(dá)分析,并通過原核表達(dá)技術(shù)獲得重組蛋白。主要研究結(jié)果如下:(1)馬氏珠母貝TNFR和TRAF基因的克隆與定量分析:本研究成功克隆得到PmTNFR1、PmTNFR2、PmTNFR5(CD40)、PmTRAF2和PmTRAF4的c DNA全長序列,分別編碼406、427、533、527和470個氨基酸。通過序列分析發(fā)現(xiàn)PmTNFR1、PmTNFR5分別存在兩個和三個TNFR家族半胱胺酸豐富結(jié)構(gòu)域,一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個死亡結(jié)構(gòu)域;PmTNFR2存在兩個TNFR域和一個跨膜域;PmTRAF2存在一個RING指結(jié)構(gòu)域、兩個鋅指結(jié)構(gòu)域、一個Coiled-coil結(jié)構(gòu)、一個c IAP2結(jié)合位點(diǎn)和一個TRAF結(jié)構(gòu)域,PmTRAF4存在三個鋅指結(jié)構(gòu)域和一個TRAF結(jié)構(gòu)域。組織定量結(jié)果顯示5個基因在免疫組織鰓和肝胰腺中表達(dá)量顯著高于其它檢測組織。(2)脂多糖(LPS)刺激、植核移植刺激條件下,5個基因在血淋巴中的表達(dá)譜:LPS刺激后,PmTNFR1和PmTNFR5基因的表達(dá)量在48 h顯著上調(diào),PmTNFR2基因的表達(dá)量在6 h和48 h顯著上調(diào);PmTRAF2基因的表達(dá)量在6 h和48 h顯著上調(diào),PmTRAF4基因在6 h顯著高表達(dá)。植核后的不同時期,PmTNFR1和PmTNFR2基因的表達(dá)量在15 d顯著上調(diào),PmTNFR5在5 d和15 d表達(dá)量顯著上調(diào);PmTRAF2基因的表達(dá)量在5 d、15 d和30 d顯著上調(diào),PmTRAF4表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異。結(jié)果表明了這5個基因參與了馬氏珠母貝免疫應(yīng)答反應(yīng)。(3)免疫刺激后NF-κB信號通路關(guān)健信號分子的表達(dá)分析:運(yùn)用Real-time PCR檢測了LPS刺激和植核移植后信號分子LITAF、TRADD、TRAF2、NIK、IKK和NF-κB的表達(dá)情況。已知PmTNFR1、PmTNFR2和PmTNFR5在LPS刺激后的48 h顯著上調(diào),在植核后的第15 d表達(dá)量上調(diào)。分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)這些信號分子的表達(dá)量的表達(dá)模式與PmTNFR1、PmTNFR2和PmTNFR5相似。說明PmTNFR1、PmTNFR2和PmTNFR5可能介導(dǎo)的NF-κB通路參與機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。(4)RNAi技術(shù)研究信號通路:運(yùn)用Real-time PCR檢測PmTNFR1和PmTNFR5基因沉默后自身及其下游信號分子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:PmTNFR1在第4 d表達(dá)量顯著下調(diào),且下游基因TRADD、Caspase-8、Caspase-3、TRAF2、NIK、IΚΚ和NF-κB具有相同的抑制表達(dá)模式;PmTNFR5在第1 d表達(dá)量顯著下調(diào),檢測其下游基因TRAF2、NIK、IΚΚ和NF-κB具有相同的抑制表達(dá)模式。推測馬氏珠母貝通過TNFR1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路和NF-κB信號通路,以及TNFR5介導(dǎo)的NF-κB信號通路參與調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng)。(5)成功構(gòu)建了pET-15b-PmTNFR5和pET-15b-PmTRAF2原核表達(dá)載體,并經(jīng)過誘導(dǎo)和純化成功獲得重組蛋白。
【圖文】：

圖 1-1 TNFR1 信號通路[113]Fig. 1-1 TNFR1 signaling pathway 介導(dǎo)的信號通路FR 1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究相比，我們對TNFR2信號通路的認(rèn)FR2與TNF-a結(jié)合后，主要募集TRAF 1-3，cIAP-1、cIAP-2蛋白增加，激活NF-κB，抑制細(xì)胞凋亡[49]。其中最主要的 1-3介導(dǎo)激活NF-κB，進(jìn)而促使細(xì)胞存活（圖1-2）。

圖1-2 TNFR2介導(dǎo)的NF-κB信號通路Fig .1-2 TNFR2-mediated NF-κB signaling pathway介導(dǎo)的信號通路腫瘤壞死因子受體家族成員一樣，CD40募集幾種不同的腫以介導(dǎo)包括NFκB，，c-Jun N末端激酶和p38絲裂原活化蛋白激激活[67]。已有研究發(fā)現(xiàn)TRAF2，3 或TRAF6 介導(dǎo)了CD40TRAF6和TRAF2介導(dǎo)響應(yīng)于CD40接合的經(jīng)典和非經(jīng)典NF激活CD40后，通過銜接蛋白TRAFs 家族成員可以介導(dǎo)兩條D40-（TRAF2、TRAF3)-NF-κB和CD40-TRAF6-NF-κB。研TRAF6介導(dǎo)活化NF-κB，TRAF2與CD40-C結(jié)構(gòu)域結(jié)合介導(dǎo)，且兩者在NF-κB活化中所占的比例存在差異[115]（圖1-3
【學(xué)位授予單位】：廣東海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 王沂;趙俊f

本文編號：2627499